临床ⅠA期肺腺癌的基因突变特征及其与患者长期预后的关系

张丽, 刘梦雯, 李琳, 等. 临床ⅠA期肺腺癌的基因突变特征及其与患者长期预后的关系[J]. 中华肿瘤杂志, 2024, 46(8):755-763. DOI: 10.3760/cma.j.cn112152-20231128-00338.

 摘   要 

目的

探讨临床ⅠA期肺腺癌的基因突变特征及其与患者预后的关系，为早期肺腺癌患者的个体化治疗提供依据。

方法

收集2007年1月至2012年10月在中国医学科学院肿瘤医院接受手术切除且随访达10年以上或随访期间出现复发或转移的临床ⅠA期肺腺癌患者63例，采用全外显子组测序（WES）技术分析肺癌组织的基因突变谱，采用单因素和多因素Cox回归分析明确患者预后影响因素。

结果

在随访期间，63例患者中13例（20.6%）出现复发或转移。WES技术分析显示，肺癌组织中表皮生长因子受体突变频率最高，达65.1%（41/63），其次为肿瘤蛋白p53、异常类脂肪酸1、低密度脂蛋白受体相关蛋白1B、雷帕霉素机械靶点、磷脂酰肌醇4，5-双磷酸3-激酶催化亚单位γ（PIK3CG）及与SWI/SNF相关基质相关的依赖于肌动蛋白的染色质调节因子亚家族A成员4，突变频率分别为30.2%（19/63）、20.6%（13/63）、15.9%（10/63）、15.9%（10/63）、15.9%（10/63）和15.9%（10/63）。多因素Cox回归分析显示，PIK3CG突变（HR=21.52，95%CI：3.19～145.01）、平滑蛋白（SMO）突变（HR=35.28，95%CI：3.12～398.39）、β-连环蛋白1（CTNNB1）突变（HR=332.86，95%CI：15.76～7 029.05）、集落刺激因子1受体（CSF1R）突变（HR=8 109.60，95%CI：114.19～575 955.17）、v-Raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源B（BRAF）突变（HR=23.65，95%CI：1.86～300.43）为临床ⅠA期肺腺癌患者预后的独立危险因素。

结论

PIK3CG、SMO、CTNNB1、CSF1R、BRAF基因突变与临床ⅠA期肺腺癌的远期复发和转移密切相关，应给予具有这些基因突变的肺腺癌患者更为密切的临床关注。

【关键词】肺肿瘤；腺癌；基因突变；预后

随着肺癌筛查的广泛开展，早期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），尤其是早期肺腺癌的检出明显增加。在临床实践中，对于早期肺腺癌患者首选的治疗方式仍为根治性切除和纵隔淋巴结清扫。然而，即使在相同分期下，患者的预后仍存在较大差异，因此仅依赖肿瘤分期系统并不足以准确地评估患者的预后。

在肺癌的生长和侵袭性进展过程中，基因突变至关重要。有研究显示，约有73.9%的中国NSCLC患者至少携带1种可靶向治疗的驱动基因突变，如表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）、Erb-B2受体酪氨酸激酶2（Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2, ERBB2）等。因此，深入研究肺癌的基因突变特征，有利于为患者个体化治疗方案的制定提供依据，从而进一步提高患者的生存率。在本研究中，我们利用全外显子组测序（whole exome sequencing, WES）技术检测了63例临床ⅠA期肺腺癌患者的基因突变情况，以探讨基因突变与临床ⅠA期肺腺癌患者远期预后的关系。

资料与方法

1. 研究对象：患者纳入标准：（1）组织学证实为肺腺癌；（2）接受根治性手术切除术；（3）接受淋巴结清扫；（4）术后病理组织可行基因检测；（5）术前2周行薄层胸部CT增强检查；（6）CT图像上肿瘤长径≤3 cm且肺门或纵隔淋巴结短径≤1 cm。排除标准：（1）术前已行抗肿瘤辅助治疗；（2）组织切片不可用或组织切片肿瘤细胞占比＜60%；（3）术后10年内有其他恶性肿瘤病史。2007年1月至2012年10月于中国医学科学院肿瘤医院接受根治性手术切除治疗的临床ⅠA期肺腺癌患者63例，其中男22例，女41例，年龄范围31～77岁。本研究遵循赫尔辛基宣言中的伦理准则，并经过中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会批准（批号：NCCN2017G-060）。

2. 临床资料收集：收集患者的临床资料，包括性别、年龄、吸烟状况、结节类型、手术方式、治疗方式等。患者的病理切片由病理医师重新阅片，根据第5版WHO肺部肿瘤组织学分类进行病理亚型诊断，按照国际肺癌联盟肺癌第8版TNM分期系统进行病理分期，并分析分化程度。

3. 随访：术后对患者进行随访，通过查阅病历或电话访谈获取患者的生存和疾病进展情况。如果无法联系到患者或患者家属，则将最后一次随访时患者的生存和疾病进展情况作为最终结果。随访内容包括体格检查和影像检查。术后前2年，每3个月进行1次胸部X线摄影，每6个月进行1次胸部CT扫描。2年以后，每6个月进行1次胸片检查，每年进行1次胸部CT扫描。本研究的结局事件为肺癌出现复发或转移。若患者出现结局事件或死亡即记录发生的时间并终止随访，若未出现结局事件则随访至2023年11月13日。

4. 组织DNA提取：将经4%甲醛固定、石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）的肺癌组织标本10 μm切片，HE染色，选取富含肿瘤细胞的区域，利用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（德国Qiagen公司）从选定的区域提取DNA。经Invitrogen Qubit 3.0 分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）和琼脂糖凝胶电泳进行质量控制后，对合格的基因组DNA样品利用QIAGEN QIAseq Human Exome Panel（德国Qiagen公司）制备文库，使用Agilent SureSelect Human All Exon V5试剂盒（美国Agilent公司）进行外显子捕获。

5. WES测序与数据分析：应用NovaSeq 6000高通量测序平台（美国Illumina公司）进行WES测序，得到原始图像数据文件，经碱基识别转化为原始测序序列，使用FastQC 0.11.2软件和Skewer 0.2.2软件对原始测序序列进行精细过滤，去除带接头的和低质量的序列。通过BWA 0.7.17软件的最大精确匹配算法将测序数据与人类基因组GRCh37/hg19参考序列进行比对。使用Picard 3.1.1软件标记重复序列，使用SAMtools 1.9软件对比对结果进行排序，筛选对比率＞95%、碱基覆盖度在10×以上且同时具有正负链支持的可信的单核苷酸多态性位点。应用Sentieon 201611.02软件对测序数据进行单核苷酸变异和小片段插入缺失变异的检测和基因分型。

6. 统计学方法：采用R 4.2.2软件和SPSS 26.0软件进行统计分析。对计量资料采用Kolmogorov-Smirnov法进行正态性检验，正态分布的计量资料以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（Q₁，Q₃）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以频数表示，两组间比较采用χ²检验、校正χ²检验或Fisher精确概率法。显著性检验均为双侧检验，检验水准α=0.05。

结  果

1. 临床特征：63例患者中，吸烟者15例。病灶位于右肺上叶23例，右肺中叶4例，右肺下叶10例，左肺上叶16例，左肺下叶10例。CT表现为纯磨玻璃结节7例，部分实性结节29例，实性结节27例。病理亚型为原位腺癌6例，微浸润性腺癌8例，浸润性腺癌49例。高分化39例，中分化22例，低分化2例。病理分期为0期6例，Ⅰ期51例，Ⅱ期3例，Ⅲ期3例。63例患者均无脉管浸润。仅行手术治疗51例，手术联合术后辅助治疗12例。手术方式为肺叶切除术59例，楔形切除术4例。

2. 复发、转移情况：到随访截止时，63例患者中，13例出现了复发或转移，50例无转移生存。无转移生存患者的随访时间为137（148，131）个月，范围120～200个月；发生复发或转移患者，自手术至复发转移的时间为35（29，85）个月，范围1～127个月。13例发生复发或转移的患者中，单纯肺转移3例，淋巴结转移2例，胸膜转移2例，骨转移2例，局部复发1例，多部位转移3例（转移的部位包括肺、胸膜、骨、脑）。有4例患者手术5年以后才出现转移，具体分别为术后127、94、90和80个月。

3. 复发转移组和无复发转移组患者的临床病理特征比较：复发转移组和无复发转移组患者的结节类型（P＜0.001）、分化程度（P=0.024）、病理N分期（P=0.006）、病理TNM分期（P=0.014）、治疗方式（P=0.017）差异有统计学意义（表1）。

4. 临床ⅠA期肺腺癌患者的基因突变谱：63例肺癌组织样本中，共检测到7 579个不同的基因突变。每例样本的基因突变数范围为31～706个，中位基因突变数为190个。在检测到的与肿瘤相关的突变基因中，EGFR突变频率最高，达65.1%（41/63），其次为肿瘤蛋白p53（tumor protein p53, TP53）、异常类脂肪酸1（fat atypical cadherin 1, FAT1）、低密度脂蛋白受体相关蛋白1B（low density lipoprotein receptor-related protein 1B, LRP1B）、雷帕霉素机械靶点（mechanistic target of rapamycin, MTOR）、磷脂酰肌醇4，5-双磷酸3-激酶催化亚单位γ（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma, PIK3CG）及与SWI/SNF相关基质相关的依赖于肌动蛋白的染色质调节因子亚家族A成员4（SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily A, member 4, SMARCA4），突变频率分别为30.2%（19/63）、20.6%（13/63）、15.9%（10/63）、15.9%（10/63）、15.9%（10/63）和15.9%（10/63，图1）。

5. 基因突变与患者预后的关系：TP53、PIK3CG、SMARCA4、平滑蛋白（smoothened, SMO）、β-连环蛋白1（catenin beta 1, CTNNB1）、集落刺激因子1受体（colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R）、v-Raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源B（v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B, BRAF）、转录病毒介导的临时因子2（transmembrane protease, serine 2, TMPRSS2）基因的突变频率在复发转移组分别为61.5%（8/13）、46.2%（6/13）、38.5%（5/13）、23.1%（3/13）、30.8%（4/13）、15.4%（2/13）、15.4%（2/13）和15.4%（2/13），在无复发转移组分别为22.0%（11/50）、8.0%（4/50）、10%（5/50）、2.0%（1/50）、0.0%（0/50）、0.0%（0/50）、0.0%（0/50）和0.0%（0/50）。两组间TP53、PIK3CG、SMARCA4、SMO、CTNNB1、CSF1R、BRAF、TMPRSS2基因的突变频率差异有统计学意义（χ²_校正＝5.9，P=0.015；χ²_校正＝8.57，P=0.003；χ²_校正＝4.31，P=0.038；Fisher精确概率法，P=0.025；Fisher精确概率法，P=0.001；Fisher精确概率法，P=0.040；Fisher精确概率法，P=0.040；Fisher精确概率法，P=0.040）。

6. 临床ⅠA期肺腺癌患者预后影响因素分析：单因素Cox回归分析结果显示，性别、结节类型、分化程度、病理分期、治疗方式、TP53突变、PIK3CG突变、SMARCA4突变、SMO突变、CTNNB1突变、CSF1R突变、BRAF突变、TMPRSS2突变为临床ⅠA期肺腺癌患者预后的影响因素（均P＜0.05，表2）。将单因素分析结果中P＜0.05的因素纳入Cox模型进行多因素回归分析，结果显示，PIK3CG突变（HR=21.52，95%CI：3.19～145.01，P=0.002）、SMO突变（HR=35.28，95%CI：3.12～398.39，P=0.004）、CTNNB1突变（HR=332.86，95%CI：15.76～7 029.05，P＜0.001）、CSF1R突变（HR=8 109.60，95%CI：114.19～575 955.17，P＜0.001）、BRAF突变（HR=23.65，95%CI：1.86～300.43，P=0.015）为临床ⅠA期肺腺癌患者预后的独立危险因素。

讨  论

肺癌的预后与多种因素有关，即使病理分期相同的患者，其预后仍然存在显著差异。为了及时发现肺癌术后复发和转移的情况，当前指南建议，早期NSCLC患者行根治性手术后需要进行定期复查，术后前3年每3～6个月复查1次，3年以后改为每年复查1次。然而在临床实践中，许多患者在随访5年后会逐渐降低随访频率甚至终止随访。肺腺癌的预后研究也主要关注5年内的随访结果，而忽略了更长时间的预后情况。为了探索早期肺腺癌患者的长期预后影响因素，我们对63例临床ⅠA期肺腺癌患者进行了10年以上的随访，并采用WES技术对这些患者的DNA进行了详细分析，发现PIK3CG、SMO、CTNNB1、CSF1R和BRAF基因突变与患者的长期预后密切相关。13例发生复发或转移的患者中，有4例为手术5年以后才出现转移，提示肺腺癌的复发或转移可能存在较长的潜伏期，也表明了预测肺腺癌患者长期预后的必要性和挑战性。

为了深入了解早期肺腺癌的遗传变异，我们采用WES测序技术检测了63例临床ⅠA期肺腺癌的基因突变谱。结果显示，这些患者常见的突变基因依次为EGFR（65.1%）、TP53（30.2%）、FAT1（20.6%）、LRP1B（15.9%）、MTOR（15.9%）、PIK3CG（15.9%）及SMARCA4（15.9%）。Zhou等对98例中国肺腺癌患者的DNA进行二代测序，结果显示，EGFR和TP53突变频率分别为66%和37%，居前两位，与本研究结果一致。然而，其他高频突变基因与本研究结果不同，分别为ERBB2（24%）、BCL6核心抑制因子（22%）、锌指蛋白结构域与家族3（19%）、B细胞迁移基因1（17%）、共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3相关激酶（16%）和含WW结构域的转录调控因子1（15%）等。这可能是由于两项研究中采用的测序面板不同所致，Zhou等采用了包含583个基因的面板，而我们在本研究中共检测到7 579个突变，更全面、更深入地对早期肺腺癌的遗传信息进行了分析。

本研究中的多因素Cox回归分析显示，PIK3CG、SMO、CTNNB1、CSF1R和BRAF基因突变是临床ⅠA期肺腺癌复发转移的独立危险因素。PIK3CG基因编码磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase, PI3K）蛋白，该蛋白可以激活PI3K通路，进而激活Akt信号通路，参与调控多种生物学过程，包括细胞存活、迁移及代谢等。多项研究证实，PI3K3CG与肺腺癌的不良预后有关。SMO基因编码SMO蛋白，该蛋白是Hedgeho通路的关键分子，参与细胞存活、增殖、上皮-间充质转化、侵袭、迁移等过程。SMO突变可以诱导程序性死亡蛋白配体1的表达并促进肿瘤细胞生长。CTNNB1基因参与编码的β-连环蛋白，是Wnt信号通路的核心分子，参与调节细胞黏附、增殖和迁移等过程。CTNNB1突变可介导EGFR、ALK和Kirsten型肿瘤病毒中的哺乳动物基因靶向治疗的耐药性。CSF1R基因编码巨噬细胞集落刺激因子受体，参与调节巨噬细胞的分化、活化、迁移等过程。CSF1R基因的突变则会导致巨噬细胞异常增殖和功能紊乱，影响肿瘤的免疫微环境，与肺癌预后不良相关。BRAF基因编码B-Raf蛋白，是Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的重要组成部分，参与调节细胞增殖、分化、凋亡等过程。有研究表明，与BRAF野生型相比，BRAF突变型NSCLC 对铂类化疗药更加不敏感。总的来讲，这些基因的突变主要涉及肿瘤的生长、侵袭、转移和耐药等生物学机制，从而影响肿瘤患者的预后。既往研究显示，肿瘤的病理亚型、病理分期等是影响肺癌预后的主要因素。然而，本研究中的多因素Cox回归分析未显示这些因素是患者预后的独立影响因素，主要原因可能是由于本研究中90%的患者均为病理分期为0或Ⅰ期的肺腺癌。

本研究存在以下局限性：首先，研究对象均来自同一家医疗中心，样本量相对较小，缺乏外部验证；其次，本研究为回顾性研究，可能存在一定的偏倚；最后，本研究仅考虑了DNA对预后的影响，未纳入其他分子生物学特征，如RNA和蛋白质。

综上所述，本研究揭示了临床ⅠA期肺腺癌的远期复发或转移相关的基因突变谱，PIK3CG、SMO、CTNNB1、CSF1R和BRAF基因突变与肺腺癌的远期复发或转移密切相关，为肺腺癌的分子分型和个体化治疗提供了新的依据和方向。