腹腔积液诊断卵巢浆液性癌的细胞病理学特征分析

引常艳华, 邹冰清, 蔡颖, 等. 腹腔积液诊断卵巢浆液性癌的细胞病理学特征分析[J]. 中华肿瘤杂志, 2023, 45(5):424-432. DOI:10.3760/cma.j.cn112152-20211201-00889.

 摘   要 

目的

分析总结卵巢浆液性癌(SOC)腹腔积液中肿瘤细胞的病理形态学及免疫细胞化学特点。

方法

采集2015年1月至2021年7月南京医科大学附属无锡人民医院收治的61例肿瘤患者的浆膜腔积液标本，包括32例SOC、10例胃肠道腺癌、5例胰腺导管腺癌、6例肺腺癌、4例良性间皮增生和1例恶性间皮瘤患者的腹腔积液，2例恶性间皮瘤患者的胸腔积液，1例恶性间皮瘤患者的心包积液，离心后制成常规涂片，将剩余积液离心后制成细胞蜡块并行常规HE染色和免疫细胞化学染色，分析其细胞形态学和免疫细胞化学特点。抽取患者空腹肘静脉血5 ml，检测血清肿瘤标志物糖类抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19－9(CA19－9)的水平。

结果

32例SOC患者中，5例为低级别浆液性癌(LGSOC)，27例为高级别浆液性癌(HGSOC)。29例(90.6%)SOC患者血清CA125增高，但与纳入研究的非卵巢原发病变患者间差异均无统计学意义(均P>0.05)；9例胃肠道腺癌和5例肺腺癌患者血清CEA阳性，阳性率高于SOC患者(均P<0.001)；5例胃肠道腺癌和5例胰腺导管腺癌患者血清CA19－9阳性，阳性率高于SOC患者(均P<0.05)。4例良性间皮增生患者的血清CA125、CEA和CA19－9均在正常范围内。LGSOC肿瘤细胞异型性小，聚集成小簇状或微乳头状，部分患者可见砂砾体；背景细胞较少，以淋巴细胞为主；制成细胞蜡块后，乳头结构更为明显。HGSOC肿瘤细胞异型性大，细胞核增大明显，且大小不等，可相差3倍以上，有时可见到核仁及核分裂象；肿瘤细胞多聚集成巢团状、乳头状及梅花状；背景细胞较多，以组织细胞为主。免疫细胞化学染色显示，AE1/AE3、细胞角蛋白7(CK7)、配对盒基因8(PAX－8)、CA125、肾母细胞瘤基因(WT1)在32例SOC中均为弥漫阳性表达。抑癌基因p53在5例LGSOC中均呈局灶阳性，在23例HGSOC中呈弥漫阳性表达，在另外4例HGSOC中呈阴性表达。胃肠道腺癌和肺腺癌多有手术史，胰腺导管腺癌的肿瘤细胞往往形成较小的细胞巢。间皮源性病变多有特征性"开窗"现象，免疫细胞化学可协助鉴别诊断。

结论

结合患者的临床表现、腹腔积液涂片及细胞块中的细胞形态学特点，可为SOC的诊断提供重要的线索，辅以免疫细胞化学检测可进一步提高诊断的准确性。

【关键词】卵巢浆液性癌；细胞病理学；腹腔积液；免疫细胞化学

上皮性卵巢癌是女性生殖器官常见恶性肿瘤，其中卵巢浆液性癌(serous ovarian carcinoma, SOC)占上皮性卵巢癌的75%，好发于绝经期女性，病死率居妇科恶性肿瘤首位。因其发病隐匿，缺乏早期筛查方法，且进展迅速，多数患者因肿瘤侵犯腹膜引起腹腔积液，导致腹痛、腹胀等症状，或无明显不适仅自觉腹围异常增大而就诊，确诊时已属晚期且伴随广泛转移，手术不能完全切除。有研究显示，17.7%的低级别浆液性癌(low－grade serous ovarian carcinoma, LGSOC)和91.8%的高级别浆液性癌(high－grade serous ovarian carcinoma, HGSOC)患者会出现恶性腹腔积液。因此，在难以获得组织学证据时，如果通过腹腔积液细胞病理学能明确诊断，对患者获得精准有效的治疗具有重要意义。在本研究中，我们分别对5例LGSOC和27例HGSOC的腹腔积液的细胞学形态及免疫细胞化学表型进行了分析，并与细胞学形态具有相似性的病变进行比较，旨在提高细胞病理医师对该病的认识和诊断的准确性，更好地指导临床及时有效地为患者制订合适的治疗方案。

资料与方法

1．浆膜腔积液标本的采集：

收集2015年1月至2021年7月南京医科大学附属无锡人民医院经腹腔积液细胞病理学诊断为SOC的细胞学标本32例，其他类型浸润性腺癌腹腔积液标本21例(胃肠道腺癌10例，胰腺导管腺癌5例，肺腺癌6例)，良性间皮增生腹腔积液标本4例，恶性间皮瘤标本4例(胸腔积液2例，腹腔积液1例，心包积液1例)。浆膜腔积液标本由临床医师采集。

2．浆膜腔积液标本的细胞病理学检测方法：

将浆膜腔积液离心后取沉淀物涂片，经95%乙醇固定后行HE染色，光镜下观察其形态学特点。剩余标本经4%甲醛固定后制成细胞沉渣包埋蜡块，4 μm厚切片，行常规HE染色和免疫细胞化学染色，光镜下观察其形态学特点和各种蛋白的表达情况。免疫细胞化学染色采用EnVision二步法，所用一抗包括广谱细胞角蛋白单克隆抗体AE1/AE3、糖类抗原125(carbohydrate antigen 125, CA125)、细胞角蛋白7(keratin 7, CK7)、细胞角蛋白20(keratin 20, CK20)、villin、配对盒基因8(paired box gene 8, PAX－8)、抑癌基因p53、肾母细胞瘤基因1(Wilm′s tumour gene 1, WT1)、钙网膜蛋白(calretinin, CR)、甲状腺转录因子1 (thyroid transcription actor 1, TTF1)、糖类抗原19－9(carbohydrate antigen 19－9, CA19－9)、上皮细胞膜抗原(epithelial membrane antigen, EMA)。试剂均购自福州迈新生物技术有限公司，根据抗体说明书和实验规范进行操作。浆膜腔积液标本均经2位及以上高年资细胞学病理医师重新阅片，并与相应临床科室高年资医师共同商讨确诊。

3．血液样本的采集和血清肿瘤标志物的检测：

抽取患者空腹肘静脉血5 ml，置于未加抗凝剂的试管中，室温下静置30 min，3 000 r/min离心10 min分离血清。使用罗氏E170全自动电化学发光仪和配套试剂盒检测血清肿瘤标志物CA125、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)和CA19－9的水平。各血清肿瘤标志物的临界参考值：CA125 35 U/ml，CEA 5 ng/ml，CA19－9 37 U/ml。如患者的检测值超过临界参考值，则为阳性。

4．临床资料收集：

收集SOC患者的临床资料，包括患者的一般状况、腹腔积液的常规和生化检查结果、诊疗经过和影像学检查图像等。

5．统计学方法：

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析。计数资料采用Fisher精确检验或χ²检验，检验水准α＝0.05。

结  果

1．SOC的临床特征：

32例SOC患者中，5例为LGSOC，年龄42~63岁，中位年龄54岁；27例为HGSOC，年龄40~76岁，中位年龄66岁。LGSOC患者中，2例就诊时主诉体检发现腹水及附件区肿块1~2周，1例下腹不适两月余，1例腹胀伴恶性呕吐1 d，1例腹胀伴进行性加重1月余。5例患者一般情况均良好，可耐受手术治疗，腹腔积液中查见肿瘤细胞后行卵巢癌肿瘤细胞减灭术，术后病理诊断为LGSOC。27例HGSOC中，6例就诊时主诉体检发现腹腔积液及附件区占位1~2周，其余21例腹胀、腹痛1月至半年。18例患者一般情况良好，腹腔积液中查见肿瘤细胞后行卵巢癌肿瘤细胞减灭术，9例患者接受术前化疗后行卵巢癌肿瘤细胞减灭术，术后病理诊断均为HGSOC。32例SOC患者超声或CT检查均显示附件区占位及腹腔积液( 图1 )。

2．SOC患者血清肿瘤标志物的表达：

不同肿瘤类型患者血清CA125、CEA和CA19－9的表达情况见 表1 。29例(90.6%)SOC患者血清CA125增高，但与纳入研究的非卵巢原发病变患者间差异均无统计学意义(均P>0.05)；9例胃肠道腺癌和5例肺腺癌患者血清CEA阳性，阳性率高于SOC患者(均P<0.001)；5例胃肠道腺癌和5例胰腺导管腺癌患者血清CA19－9阳性，阳性率高于SOC患者(均P<0.05)。4例良性间皮增生患者的血清CA125、CEA和CA19－9均在正常范围内。

3．SOC腹腔积液的细胞涂片特点：

SOC患者腹腔穿刺液常规及生化检查均提示为渗出液，其中26例为血性积液。(1)LGSOC：肿瘤细胞聚集成小簇或微乳头状，细胞轻－中度异型。细胞核大小较一致，椭圆形或圆形，核染色质较细腻，1例核分裂象计数约为1个/10高倍视野(high－power field, HPF)，余4例均未见明确核分裂象。2例可见砂砾体，背景细胞较少，为淋巴细胞和组织细胞，且以淋巴细胞为主( 图2 )。(2)HGSOC：肿瘤细胞多聚集，呈不规则巢团状、乳头状及梅花状结构，同时也可见散在的肿瘤细胞，肿瘤细胞异型性大，细胞核增大明显，且大小不等，可相差3倍以上，核形不规则，核染色质粗，可见双核、多核，部分可见核仁，27例HGSOC患者均可见核分裂象(核分裂象计数3~9个/10 HPF，中位数为5个/10 HPF)，细胞质多少不一，常见分泌空泡。有6例可见砂砾体。背景细胞较多，为组织细胞和淋巴细胞，且以组织细胞为主( 图3 )。LGSOC和HGSOC腹腔积液肿瘤细胞的细胞学形态特征见 表2 。

4．SOC腹腔积液的细胞蜡块特点：

经离心沉淀后切片，肿瘤细胞比直接涂片更为集中，立体感增强，可呈现一些组织学形态。LGSOC乳头状结构明显，细胞团周围多有空白裂隙( 图4 )。HGSOC的肿瘤细胞多排列成梅花状或乳头状，并见较多散在肿瘤细胞，部分患者可见核仁及砂砾体( 图5 )。免疫细胞化学染色结果显示，所有SOC患者的肿瘤细胞阳性表达AE1/AE3、CK7、PAX－8、CA125和WT1，不表达CK20、villin和calretinin；p53在所有LGSOC中呈局灶阳性；27例HGSOC中，23例(85.2%)患者肿瘤细胞p53呈弥漫阳性表达，4例表达阴性( 图6 ， 表2 )。

5．与SOC细胞学形态相似的非卵巢起源腺癌的细胞学特点：

(1)胃肠道腺癌：10例均有胃肠道腺癌手术史。肿瘤细胞体积较大，胞质较丰富，核异型性明显，因胞质内有黏液分泌，所以胞核常偏位，核分裂象易见。其中6例患者的腹腔积液中肿瘤细胞呈团片状聚集，立体感明显，4例腹腔积液中肿瘤细胞间黏附性差，多数肿瘤细胞单个散在分布，细胞间大小差异大，可达3倍以上，见印戒样细胞( 图7 )。(2)胰腺导管腺癌：腹腔积液中肿瘤细胞呈柱状细胞形态，多聚集成小团状，散在肿瘤细胞较少，细胞间排列紧密，呈腺样或乳头状结构，CA19－9呈强阳性表达( 图8 )。(3)肺腺癌：6例患者均有恶性胸腔和腹腔积液，且均有肺腺癌手术切除史。腹腔积液中肿瘤细胞排列成团状，核大，圆形或卵圆形，核膜不规则，核染色质呈细颗粒状，CK7和TTF1阳性表达( 图9 )。与SOC细胞学形态相似的非卵巢起源腺癌与SOC细胞学特征比较见 表3 。

6．与SOC细胞学形态相似的间皮源性病变的细胞学特点：

(1)良性间皮增生：细胞多散在分布，仅少量聚集成团。良性间皮细胞形态大小规则，边界模糊，核圆形或卵圆形，居中或轻度偏位，核膜光滑，核染色质细腻，胞质丰富，两个或多个间皮细胞间会出现特征性的开窗现象( 图10 )。(2)恶性间皮瘤：肿瘤细胞排列成球状、乳头状、腺腔样及梅花状，肿瘤细胞团外缘呈裙边样，细胞核增大，核染色质增粗，核质比增高，可出现双核、多核细胞，常见核仁及核分裂象，calretinin、WT1和EMA阳性表达( 图11 )。与SOC细胞学形态相似的间皮源性病变与SOC细胞学特征比较见 表3 。

讨  论

SOC发病隐匿，多数患者在就诊时已是晚期，且超过1/3的患者在就诊时已出现恶性腹腔积液。通过腹腔穿刺术获取腹腔积液是一种安全、简单的操作，且放腹水可减轻患者腹痛、腹胀症状，多为治疗所需，不增加患者额外的负担，容易被患者接受。尤其对于一般状况差、难以耐受手术且处于进展期的恶性肿瘤患者，常常无法获得组织学标本，此时，腹腔积液就成为患者进行病理诊断的唯一标本来源。

CA125是目前临床应用最广泛的卵巢癌肿瘤标志物。在本研究中，29例(90.6%)SOC患者血清CA125增高，但与纳入研究的非卵巢来源的恶性肿瘤患者差异无统计学意义。此外，SOC患者的血清CEA和CA19－9均处于正常范围，而胃肠道腺癌和肺腺癌患者血清CEA升高，胃肠道腺癌和胰腺导管腺癌患者血清CA19－9升高。因此，肿瘤标志物对SOC的诊断有一定提示作用，但并不能明确诊断，而通过腹腔积液细胞病理学诊断SOC则具有相当重要的临床价值和可行性。2014年世界卫生组织提出了SOC的两级分级系统，将SOC分为LGSOC和HGSOC，该分级系统对SOC的临床治疗及预后评估具有重要意义。然而，该分级系统对腹腔积液中的转移性SOC尚无具体的分级标准，需要在临床实践中进一步分析总结。

本研究结果显示，LGSOC与HGSOC的细胞学特征有以下差异：(1)低倍镜下：LGSOC细胞排列成乳头状结构，肿瘤细胞周围有空白裂隙，而HGSOC细胞呈不规则巢团状、乳头状或梅花状结构，同时也可见较多散在分布的肿瘤细胞。此外，LGSOC中背景细胞较少，且以淋巴细胞为主，而HGSOC中背景细胞较多，且以组织细胞为主。(2)高倍镜下：LGSOC细胞异型性小，核分裂象无或少见，而HGSOC细胞重度异型，可见双核、多核，部分可见核仁及核分裂象。SOC的两级分级系统是在组织病理的基础上建立的，在SOC组织中，LGSOC细胞核轻－中度异型，核分裂象通常为3~5个/10 HPF；HGSOC细胞核重度异型，核分裂象通常>12个/10 HPF。在本研究中，5例LGSOC腹腔积液的细胞学涂片中仅有1例找到了核分裂象，27例HGSOC腹腔积液的细胞学涂片核分裂象计数均<12个/10 HPF。产生该现象的原因尚不明确，我们推测可能与脱落至腹腔积液中的肿瘤细胞的微环境发生改变，从而增殖受到抑制有关。因此，在细胞病理学诊断中，核分裂象计数对于鉴别LGSOC与HGSOC的参考价值有限，而细胞核的异型性是SOC分级的关键，这与Seidman等和Vang等的研究结果相似。(3)免疫细胞化学染色方面：p53在LGSOC细胞中呈局灶阳性表达，而在大部分HGSOC细胞中呈弥漫阳性表达，个别病例呈阴性。因此，与组织病理学相似，p53在LGSOC中呈局灶阳性表达，而在HGSOC中呈"全或无"式表达。(4)其他特征：SOC患者恶性腹腔积液多为血性，涂片背景细胞多为组织细胞和淋巴细胞。但LGSOC患者腹腔积液的背景细胞较少，以淋巴细胞为主，而HGSOC患者腹腔积液的背景细胞较多，且以组织细胞为主。肿瘤性腹腔积液中背景细胞的量及种类是否与肿瘤的侵袭性有关值得进一步研究。

诊断腹腔积液中的转移性SOC主要需与间皮源性病变相鉴别。良性间皮细胞多边界模糊，核圆形或卵圆形，居中或轻度偏位，核膜光滑，核染色质细腻，细胞间会出现特征性的"开窗"现象，鉴别并不困难。恶性间皮细胞可以排列成乳头状、腺腔样及梅花状结构，肿瘤细胞团外缘呈裙边样，细胞异型性大，细胞核形态与转移性腺癌细胞相似。此外，反应性的间皮细胞也会出现前述恶性细胞的部分形态特征，从而增加了诊断的难度。但间皮细胞表达calretinin和WT1，而腺癌则表达相应组织来源的抗原，可资鉴别。

另外还需要与其他类型的腺癌相鉴别。腺癌是恶性腹腔积液中最常见的病理类型，虽然腺癌有共同的形态特征，比如肿瘤细胞常单个散在或成团排列，单个散在的肿瘤细胞常为圆形或椭圆形，成团排列的肿瘤细胞常呈三维立体结构外观，但是不同组织来源的腺癌其形态和结构仍有差异，且可表达相应的抗原，为诊断提供了有用线索。(1)胃肠道腺癌：患者多有胃肠道腺癌手术史，血清及腹腔积液中肿瘤标志物CEA常升高。肿瘤细胞异型性大，因细胞质内含有黏液，所以胞核常偏位，可资鉴别。鉴别困难时可辅以免疫细胞化学检测，胃肠道腺癌常表达CK7、CK20、villin和CDX－2等，而SOC多表达WT1和PAX－8等。(2)胰腺导管腺癌：腹水中肿瘤细胞呈柱状，多聚集成小团状，几乎不出现大片聚集的肿瘤细胞，且散在肿瘤细胞较少，细胞排列紧密，呈腺样或乳头状结构。血清及腹腔积液中肿瘤标志物CA19－9常升高，免疫细胞化学染色CA19－9在胰腺导管腺癌中呈强阳性表达，而在SOC中不表达。此外，CK7、CK20和villin三联检查有助于二者的鉴别，胰腺导管腺癌中CK7和villin一般为阳性，SOC中CK7为阳性，而villin为阴性，CK20在胰腺导管腺癌中的阳性表达率为23%，而在SOC中不表达。(3)肺腺癌：当SOC分化较差，没有砂砾体出现，尤其呈小乳头状排列为主时，从细胞形态学上与肺微乳头状腺癌很难鉴别，此时需要结合患者的临床病史及免疫细胞化学特征。肺腺癌的腹腔积液多产生于胸腔积液之后，仅小部分患者同时出现胸腔积液和腹腔积液，且大部分患者有肺腺癌手术史，或影像学检查可以发现肺部占位病变。免疫细胞化学检测显示，肺腺癌中CK7和TTF1为阳性，PAX－8和WT1为阴性，而SOC中CK7和TTF1为阴性，PAX－8和WT1为阳性。

总之，SOC发病隐匿，容易产生恶性腹腔积液，且有时为患者病理诊断的唯一标本来源。通过腹腔积液明确诊断SOC，并进一步确定其分级，关系到肿瘤的诊断及临床分期，对临床医师制订合适的治疗方案具有重要意义，特别是对于一些年龄较大或身体状况较差难以耐受手术，以及肿瘤太大不宜直接行手术切除的患者。因此，在临床病理诊断实践中，积极开展通过腹腔积液细胞病理学诊断LGSOC和HGSOC的尝试和探索，有助于提高不能手术SOC的诊断水平和治疗效果，从总体上改善SOC患者的预后。