小细胞肺癌患者骨髓肿瘤细胞的检测及其临床价值

王莹, 鲁葆华, 高远, 等. 小细胞肺癌患者骨髓肿瘤细胞的检测及其临床价值[J]. 中华肿瘤杂志, 2024, 46(5):419-427. DOI:10.3760/cma.j.cn112152-20231014-00193.

 摘   要 

目的

探讨小细胞肺癌（SCLC）患者骨髓肿瘤细胞的检测与临床特征及疗效和预后的关系。

方法

前瞻性纳入2018年1月至2022年10月首都医科大学附属北京胸科医院诊断的初治SCLC患者113例，治疗前抽取骨髓液分别采用液基细胞学检测肿瘤细胞、采用差相富集-免疫荧光原位杂交（SE-iFISH）平台检测播散肿瘤细胞（DTCs）。采用χ²检验分析两种方法检测结果与患者临床特征及疗效的相关性，采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，采用Cox比例风险回归模型进行生存分析。

结果

骨髓液基细胞学阳性率为15.93%（18/113），液基细胞学阳性患者中肝及骨转移率均高于阴性患者（肝转移率分别为55.56%和11.58%；P＜0.001；骨转移率分别为77.78%和16.84%，P＜0.001），血小板减低更多见（16.67%和2.11%，P=0.033）。SE-iFISH检测DTCs阳性率为92.92%（105/113），DTCs≥111个/3 ml的患者中肝及骨转移率均明显高于DTCs＜111个/3 ml的患者（肝转移率分别为37.93%和11.90%，P=0.002；骨转移率分别为44.83%和20.23%，P=0.010），血小板减低发生率明显升高（13.79%和1.19%，P=0.020）。疾病控制组和疾病进展组的骨髓液基细胞学阳性率分别为12.00%（12/100）和46.15%（6/13），差异有统计学意义（P=0.002），骨髓SE-iFISH检测DTCs分别为29（8，110）个/3 ml和64（15，257）个/3 ml，差异无统计学意义（P=0.329）。骨髓液基细胞学阳性患者中位无进展生存时间（PFS）为6.33个月，低于阴性患者（中位PFS为9.27个月，P=0.019），中位总生存时间（OS）为8.03个月，亦低于阴性患者（中位OS为19.50个月，P=0.033）。骨髓SE-iFISH检测DTCs≥111个/3 ml患者的中位PFS为6.83个月，低于DTCs＜111个/3 ml患者（中位PFS为9.50个月，P=0.004），中位OS为11.20个月，也低于DTCs＜111个/3 ml患者（中位OS为20.60个月，P=0.019）。多因素Cox回归分析显示，疾病分期（HR=2.806，95% CI：1.499～5.251，P=0.001）和骨髓SE-iFISH检测DTCs数量（HR=1.841，95% CI：1.095～3.095，P=0.021）是SCLC患者PFS的独立影响因素，疾病分期是SCLC患者OS的独立影响因素（HR=2.538，95% CI：1.169～5.512，P=0.019）。

结论

骨髓液基细胞学检测肿瘤细胞和SE-iFISH检测DTCs两种方法临床可行，液基细胞学阳性或DTCs≥111个/3ml均与患者远处脏器转移相关，DTCs≥111个/3 ml是SCLC患者较差PFS的独立影响因素。

【关键词】小细胞肺癌；骨髓；液基细胞学；差相富集-免疫荧光原位杂交；播散肿瘤细胞；转移；预后

小细胞肺癌（small cell lung cancer， SCLC）占肺癌总数的 10%～15%，尽管大多数患者对一线放、化疗敏感，但复发转移迅速、临床预后极差，5年生存率不足7%。目前SCLC分期系统包括传统的美国退伍军人肺癌协会（Veterans Administration Lung Study Group， VALSG）分期和美国癌症联合会（American Joint Committee on Cancer， AJCC）/国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control， UICC）的TNM分期系统，TNM分期主要用于指导占比不足5%的T1～2N0M0患者手术治疗，多数SCLC患者的治疗依据VALSG分期笼统地分为局限期和广泛期。在临床实践中可以看到，相同分期的SCLC患者预后千差万别，局限期患者部分能长期生存，部分却在同步放化疗过程中很快出现疾病进展，广泛期患者仅少数能长期生存。有研究表明，微转移是导致相同分期肺癌患者生存差异的原因之一，但目前临床采用的影像学检查方法无法发现隐匿的肿瘤微转移病灶。

血行转移是SCLC的主要转移方式之一。外周血中具有转移能力的肿瘤细胞往往会在微小血管周围形成生态位进入休眠状态，后续条件合适时增殖形成明显的转移灶。这些通过外周血播散到远隔脏器的肿瘤细胞称为播散肿瘤细胞（disseminated tumor cell， DTC）。骨髓由于具有较为独特的结构和血流特点，往往是肿瘤细胞血行转移最早到达并聚集成灶的组织，是DTCs最常见的存贮器和休眠场所，在肿瘤转移中起重要作用。近年来，循环肿瘤细胞检测技术发展迅速，美国食品与药品管理局批准的CellSearch系统因依靠单一上皮标志物EpCam捕获肿瘤细胞而逐渐受到挑战，差相富集-免疫荧光原位杂交（subtraction enrichment and immunostaining-fluorescence in situ hybridization， SE-iFISH）平台是循环肿瘤细胞检测技术的后起之秀，主要应用8号染色体异倍体探针来捕获循环肿瘤细胞，不完全依赖肿瘤细胞表面标志物的表达，可有效富集DTCs并进行异质性鉴定。目前，关于SCLC患者骨髓肿瘤细胞的研究较少，且缺乏规范的检测方法和统一的诊断标准，骨髓肿瘤细胞的检测及临床价值有待进一步深入研究。在本研究中，我们采用液基细胞学和SE-iFISH两种方法分别对SCLC患者骨髓DTCs进行检测鉴定，分析骨髓DTCs与患者临床特征和疗效的相关性及两种方法检测结果的预后意义，旨在为进一步优化SCLC的临床管理、推动SCLC的精准治疗开辟新思路。

资料与方法

1. 研究对象：纳入标准：（1）经组织病理或细胞学确诊的SCLC患者；（2）年龄≥18岁；（3）不能手术的初治患者；（4）体能状态（performance status， PS）评分≤2分，或虽然PS＞2分但伴有肿瘤压迫所致急症且经评估能耐受一线化疗者；（5）预计生存时间≥3个月；（6）经评估能耐受化疗者；（7）合并基础疾病但控制稳定；（8）各脏器功能正常，无治疗禁忌。排除标准：（1）处于妊娠期的女性；（2）治疗依从性差或有严重精神类疾病的患者。2018年1月至2022年10月首都医科大学附属北京胸科医院收治的符合入组条件的SCLC患者113例，其中男91例，女22例，年龄32～75岁，中位年龄为65岁。本研究为单中心前瞻性非干预性临床研究，经北京胸科医院伦理委员会批准（BJXKYY 201802-01），入组患者或家属均签署知情同意书。

2. 骨髓液基细胞学诊断：在治疗前，以髂后上棘为穿刺点行骨髓穿刺，每例患者抽取3 ml骨髓。加入CytoRich红色固定液固定样本，去除红细胞及血凝块，离心浓缩单个核细胞，以缓冲液清洗样本，制备细胞悬液。将细胞悬液倒入沉降室内，静置后弃去废液，无水乙醇脱水，制片。检查涂片质量，确保薄层细胞抹片均匀。染色，在二甲苯中浸泡5 min，封片。涂片中见到明确的恶性肿瘤细胞判断为阳性，否则判断为阴性。

3. SE-iFISH检测：在治疗前，以髂后上棘为穿刺点行骨髓穿刺，每例患者抽取3 ml骨髓。使用非EpCam依赖的SE-iFISH检测试剂盒（泰州赛特生物医药科技有限公司产品），将瘤标免疫荧光染色和8号染色体荧光原位杂交技术整合，检测DTCs的数量，并根据细胞大小、8号染色体数目及细胞表面上皮/间质标志物EpCam/vimentin的表达对不同DTCs亚型进行分类。严格按照试剂盒说明中的操作步骤进行。DTC鉴定标准：细胞核4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino2-phenylindole， DAPI）⁺ CD45^- CD31^- 8号染色体异倍体，免疫荧光染色肿瘤标志物EpCam或vimentin可阳性或阴性。若8号染色体为2倍体而EpCam或vimentin阳性亦判断为DTC。

4. 患者的分期、治疗及疗效评价：肿瘤分期参考VALSG分期和第8版AJCC/UICC TNM分期系统。患者均根据指南推荐方案进行治疗，广泛期患者接受依托泊苷联合铂类化疗±免疫治疗（阿替利珠单抗或度伐利尤单抗），局限期患者根据情况行同步放化疗或化疗和放疗序贯治疗。治疗2个周期后，根据实体瘤疗效评价标准（response evaluation criteria in solid tumors， RECIST）1.1进行疗效评价，疗效分为完全缓解（complete response， CR）、部分缓解（partial response， PR）、疾病稳定（stable disease， SD）和疾病进展（progressive disease， PD）。

5. 随访：对患者进行电话随访及电子病例查阅，每3个月1次，末次随访日期为2023年3月30日。失访3例，失访率为2.7%。

6. 统计学方法：应用SPSS 25.0软件进行统计分析。对计量资料进行Kolmogorov-Smirnov正态性检验，非正态分布数据以M（Q₁，Q₃）表示。计数资料组间比较采用χ²检验。采用Kaplan-Meier法计算无进展生存时间（progression-free survival， PFS）和总生存时间（overall survival， OS），绘制生存曲线。生存率组间比较采用Log rank检验。PFS和OS影响因素的多因素分析采用Cox比例风险回归模型。检验水准α=0.05。

结  果

1. SCLC患者的临床特征：113例SCLC患者中，有吸烟史91例；PS评分0～1分104例，2～3分9例；局限期27例，广泛期86例；伴有肝转移21例，骨转移30例，脑转移14例；白细胞减少4例，贫血9例，血小板减少5例。

2. SCLC患者骨髓液基细胞学和SE-iFISH检测DTCs结果：113例SCLC患者中，18例骨髓液基细胞学阳性（图1），阳性率为15.93%。18例骨髓液基细胞学阳性患者中，影像学分期为局限期1例，广泛期17例。105例SE-iFISH检测骨髓DTCs阳性（图2），阳性率为92.92%。18例骨髓液基细胞学阳性患者SE-iFISH均检测到DTCs。105例SE-iFISH检测骨髓DTCs阳性患者中，影像学分期为局限期24例，广泛期81例。SE-iFISH检测的DTCs数量为0～14 000个/3 ml，M（Q₁，Q₃）为30（10，111）个/3 ml，经正态性检验为非正态分布（Z=0.45，P＜0.05）。

3. SCLC患者骨髓液基细胞学和SE-iFISH检测DTCs结果与临床特征的关系：SCLC患者骨髓液基细胞学检测结果与肝转移、脑转移、血小板减少有关，液基细胞学阳性患者中肝及骨转移率均高于阴性患者（肝转移率分别为55.56%和11.58%，P＜0.001；骨转移率分别为77.78%和16.84%，P＜0.001），血小板减低更多见（16.67%和2.11%，P=0.033；表1）。

参照文献［9］，以骨髓SE-iFISH检测DTCs的Q₃为界值，将患者分为DTCs＜111个/3 ml组（n=84）和DTCs≥111个/3 ml组（n=29）进行分析。SE-iFISH检测骨髓DTCs与肝转移、脑转移、血小板减少有关，DTCs≥111个/3 ml的患者中肝及骨转移率均明显高于DTCs＜111个/3 ml的患者（肝转移率分别为37.93%和11.90%，P=0.002；骨转移率分别为44.83%和20.23%，P=0.010），血小板减低发生率明显升高（13.79%和1.19%，P=0.020；表1）。

4. SCLC患者骨髓液基细胞学和SE-iFISH检测DTCs结果与临床疗效的关系：治疗2个周期后疗效为PR 83例，SD 17例，PD 13例。根据疗效将患者分为疾病控制组（PR+SD）和疾病进展组（PD），疾病进展组骨髓液基细胞学阳性率（46.15%）高于疾病控制组（12.00%；χ²=10.02，P=0.002；表2）。疾病控制组和疾病进展组骨髓SE-iFISH检测DTCs分别为29（8，110）个/3 ml和64（15，257）个/3 ml，两组比较，差异无统计学意义（Z=-0.977，P=0.329）。

5. SCLC患者骨髓液基细胞学和SE-iFISH检测DTCs结果与预后的关系：骨髓液基细胞学阳性患者中位PFS为6.33个月（95% CI：6.12～6.54个月），低于阴性患者（中位PFS为9.27个月，95% CI：7.89～10.65个月；χ²=5.53，P=0.019；图3），中位OS为8.03个月（95% CI：5.29～10.77个月），亦低于阴性患者（中位OS为19.50个月，95% CI：9.99～29.00个月；χ²=4.57，P=0.033；图4）。骨髓SE-iFISH检测DTCs≥111个/3 ml患者的中位PFS为6.83个月（95% CI：5.91～7.75m），低于DTCs＜111个/3 ml患者（中位PFS为9.50个月，95% CI：7.25～11.75个月；χ²=8.50，P=0.004；图5），中位OS为11.20个月（95% CI：7.13～15.27个月），也低于DTCs＜111个/3 ml患者（中位OS为20.60个月，95% CI：8.28～32.92个月；χ²=5.49，P=0.019；图6）。

多因素Cox回归分析显示，疾病分期和骨髓SE-iFISH检测DTCs数量是SCLC患者PFS的独立影响因素（P值分别为0.001和0.021，表3），疾病分期是SCLC患者OS的独立影响因素（P=0.019，表4）。

讨  论

SCLC恶性程度高，侵袭性强，易早期出现远处转移。骨髓转移在SCLC患者中常见且与疾病复发转移相关，早期诊断骨髓转移对于患者风险分层及预后监测具有重要意义。然而，骨髓转移早期阶段常因缺乏典型症状而被医师忽视，骨髓穿刺的有创性限制了其在SCLC患者中的应用，因此骨髓转移的临床价值往往被低估。

美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network， NCCN）指南推荐，初治SCLC患者如果外周血涂片中发现有核红细胞、中性粒细胞或血小板减少，建议进行骨髓穿刺或骨髓活检辅助诊断，约5%的患者存在骨髓单器官转移。相较于骨髓活检，骨髓细胞学检查被认为是诊断骨髓转移癌更为敏感的方法，可能与转移灶中纤维成分少及肿瘤细胞低黏附性有关。Zych等对146例SCLC患者（局限期患者56例，广泛期患者90例）常规进行双侧骨髓穿刺细胞学检查，有28例（19.2%）诊断为骨髓转移。在本研究中，我们采用液基细胞学方法对113例SCLC患者进行骨髓肿瘤细胞检测，18例诊断为骨髓转移，阳性率为14.63%，其中仅1例患者骨髓为唯一转移灶。另外，我们首次探索性应用SE-iFISH方法根据肿瘤细胞8号染色体异倍体及瘤标标志物对SCLC患者骨髓DTCs进行检测，阳性率为92.92%，远高于传统液基细胞学阳性率，且DTCs数量分布差异性大。尽管有大量研究证实循环肿瘤细胞在SCLC患者疗效评价和预后评估中有重要临床价值，但是将骨髓DTCs检测结果应用于SCLC患者诊断远处转移、改变临床分期及治疗决策制定仍然任重道远。首先，DTCs检测技术原理和方法不同导致判读标准及结果存在较大差异，分离与鉴定技术亟待规范和标准化；其次，DTCs存在高度异质性，不同细胞亚群在SCLC患者疾病进程中临床意义不同，需进一步研究明确；最后， DTCs数量受昼夜节律的影响，检测时间需进行标准化以探索其转化价值。如何克服上述局限性，并将DTCs检测结果作为影像学诊断的有效补充应用于临床实践，需要更多基础及临床研究数据的支撑。

肿瘤细胞从原发灶脱落入血后需要找到合适的部位归巢再形成转移灶定植，这一过程并不是随机的，而是有一定器官的选择性。骨髓是肿瘤细胞最佳的归巢部位，除了对其简单的容留，骨髓还可对肿瘤细胞进行“加工”使其适应于其他器官，从而导致广泛的转移和复发。有研究显示，约15%～30%的乳腺癌患者骨髓中发现DTCs，DTCs不仅和骨转移有关，还能促进其他脏器的转移；胃癌患者骨髓中DTCs与远处转移相关，且是独立预后因素。本研究结果也显示，骨髓液基细胞学阳性患者肝及骨转移的发生率明显高于液基细胞学阴性患者，SE-iFISH检测骨髓DTCs数量多的患者较DTCs数量少的患者肝及骨转移更多见，提示骨髓内肿瘤细胞阳性或DTCs数量升高与患者远处转移密切相关。有研究表明，骨髓中有成分对肿瘤细胞起保护作用，使其产生化疗耐药。本研究亦证实，骨髓液基细胞学阳性的SCLC患者临床疗效差，而DTCs数量与患者疗效未见明显关联，与我们既往研究的结果一致，考虑这可能与DTCs的异质性有关。肿瘤细胞侵袭骨髓，破坏骨髓屏障，干扰正常造血过程，抑制造血干细胞的发育，因此，白细胞减少、贫血及血小板减少是骨髓受累的重要表现。本研究结果显示，骨髓液基细胞学阳性或SE-iFISH检测DTCs数量升高均与患者血小板减少有关，但未发现与白细胞减低、贫血的相关性。我们的研究结果支持SCLC可能是一种全身性疾病的观点。骨髓穿刺或需更广泛地推荐应用于SCLC患者，除骨髓病理细胞学诊断外，SE-iFISH检测DTCs与患者远处转移密切相关且在预后预测中亦有重要的临床价值。

骨髓转移与治疗抵抗及不良预后的关系已在乳腺癌、结肠癌等多种实体瘤中得到了证实。本研究中单因素分析显示，骨髓液基细胞学阳性SCLC患者PFS和OS均低于阴性患者，DTCs≥111个/3 ml患者的PFS和OS也低于DTCs＜111个/3 ml患者，提示骨髓转移的SCLC患者预后差。多因素Cox回归分析显示，SE-iFISH检测骨髓DTCs是SCLC患者PFS的独立影响因素，与既往在乳腺癌和胃癌患者中开展的相关研究结果相吻合，提示SE-iFISH检测骨髓DTCs在诊断SCLC骨髓转移、判断患者预后方面可能有更好的临床价值。

综上所述，发生骨髓转移的SCLC患者血小板减少多见，骨髓液基细胞学和SE-iFISH检测DTCs数量与SCLC患者的远处转移有关，骨髓液基细胞学与SCLC患者的化疗疗效有关，SE-iFISH检测DTCs数量是SCLC患者PFS的独立影响因素，两种检测方法在SCLC患者的疗效判断及预测预后方面各具优势，SE-iFISH具有较好的检测效能。