邹龄娇, 张瑜, 岳华, 等丨多孔PLGA微球作为新型冠状病毒疫苗佐剂的研究

文摘 2024-05-01 11:28 北京

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多孔PLGA微球作为新型冠状病毒疫苗佐剂的研究

邹龄娇 ^1,² 张瑜 ^2,³岳华 ^2,³ 马光辉 ^1,^2,³

1. 群马大学理工学部分子科学部，日本群马 376-8515
2. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190
3. 中国科学院大学化学工程学院，北京 100049

DOI：10.12034/j.issn.1009-606X.223218

摘要聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制备的纳/微颗粒已被证明具有良好的疫苗佐剂效果。现有研究中，对于PLGA疫苗递送微球的研究主要集中在抗原装载/吸附效率的提升或多佐剂共递送以增强免疫效果上。然而，对于微球结构本身的多样性在免疫效果提升方面的探索仍较为匮乏。通过对微球结构进行合理化设计，制备出多孔微球将抗原“后装载”到微球内部的方法或可实现抗原的无损装载与延长递送，从而开发出高效的新型冠状病毒疫苗递送佐剂。本工作以乳液法制备了PLGA多孔微球与实心微球，二者除了多孔微球具有内部空腔和表面小孔的独特结构外，在微球粒径、表面电势上均无显著区别。由于PLGA多孔微球内孔大、外孔小的特征，抗原投入浓度5.71 mg/mL时，包埋率达到10.81%。在延长抗原体内滞留时间上，相对于游离抗原3天的滞留终点和实心微球混合抗原5天的滞留终点，装载于多孔微球中的抗原的体内滞留时间延长至15天。在体液免疫效果的提升上，与新冠抗原混合实心微球疫苗组相比，装载新冠抗原的多孔微球疫苗组的IgG滴度上升速度最大值V_max是其1.73倍，响应水平更高；达到V_max的时间t比其提前了2.8天，起效时间更早；疫苗接种后6~16周期间，IgG抗体滴度均高于实心微球组，具有更优维持抗体滴度的潜力。

关键词 PLGA微球；多孔微球；抗原装载；新冠疫苗佐剂

1 前言

聚乳酸-羟基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolicacid), PLGA]是目前应用最成功的生物可降解聚合物之一，由于其水解产生的代谢物单体乳酸和羟基乙酸是内源性化合物，能够通过三羧酸循环被人体全部代谢，因此PLGA被认为在药物递送或生物材料应用中产生的系统毒性极低^[1,2]。同时，以PLGA材料制备的纳/微颗粒不仅可以提高疫苗的免疫原性，表现出良好的佐剂效果^[3-10]，还能实现抗原的缓慢释放，增强体液免疫应答^[11-18]。截至2023年5月，全球共有14款PLGA微球制剂获批用于人体药物递送，例如用于治疗局部晚期或转移性前列腺癌的醋酸曲普瑞林微球，用于治疗儿童中枢性性早熟的醋酸亮丙瑞林微球，用于改善2型糖尿病血糖控制的艾塞那肽微球。然而，用于疫苗递送的PLGA纳/微球产品至今尚未成功上市。

通过PLGA微球装载抗原递送疫苗的想法最早在20世纪90年代初被提出^[19,20]。早期研究中，抗原装载通常与微球制备同时进行，该过程需在有机溶剂环境中且伴随强烈的机械搅拌，容易造成抗原表位严重丢失和抗原大量降解，导致疫苗免疫原性差，免疫效果不佳^[21-23]。为解决上述问题，Kazzaz等^[24]通过采用在PLGA微球表面吸附艾滋病毒抗原HIV-1 gp120蛋白或B型脑膜炎奈瑟菌抗原，同时微球内部包埋免疫增强剂单磷酰脂质A和RC529的方法，构建了艾滋病毒和B型脑膜炎PLGA微球疫苗。这种PLGA微球表面吸附抗原的方法机理较复杂，受到包括静电引力、疏水相互作用及聚合物与蛋白质的结构适应性等多种作用力的共同调控，因此通过在PLGA微球表面直接吸附抗原的疫苗递送方法通常适用于一些特定的蛋白^[25,26]。Lu等^[27]通过向聚乳酸微球中引入阳离子脂十二烷基二甲基溴化铵，成功使微球带正电。该策略加强了静电相互作用，提高了抗原吸附效率，促进了抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells, APCs)内吞抗原，使后续免疫应答得到提升。然而这种引入阳离子脂质的微球修饰方法在抗原装载效率的提升、抗原的可控释放及抗原暴露于体内微环境中被酶类快速降解的问题上仍需进一步优化。现有研究中，对于PLGA疫苗递送微球的研究主要集中在抗原装载/吸附效率的提升或多佐剂共递送以增强免疫效果上^[24,27-29]。然而，对于微球结构本身的多样性在免疫效果提升方面的探索仍较为匮乏。

在上述背景下，本研究通过对微球结构进行合理化设计，采用W₁/O/W₂复乳法制备了PLGA多孔微球。通过微球表面孔道与内部多孔结构，进行抗原的“后装载”。这种装载过程进行于微球制备完成之后，且条件温和，可以避免制备过程产生的抗原降解以及代谢相关酶类切割导致的抗原表位丢失，保护了抗原的免疫原性。本研究为了验证多孔结构的微球在新冠疫苗中的佐剂效果，制备了实心微球作为结构对照组。首先从材料制备的角度表征了多孔微球与实心微球在形貌、结构与性质上的区别与联系。通过模式蛋白的装载，考察了多孔微球的抗原装载形态和抗原包埋率，确定了多孔微球对抗原的体外释放终点。在体外释放结果的指导下，以游离蛋白为空白对照组，将实心微球与抗原混合作为结构对照组，考察了装载于多孔微球内部的抗原蛋白的体内释放终点。然后，以市售疫苗常用铝佐剂混合新冠抗原作为阳性对照组，以实心微球与新冠抗原的混合物作为结构对照组，考察了多孔结构微球作为新冠疫苗佐剂的免疫提升效果。最后，确认了多孔微球作为疫苗佐剂的生物安全性。

2 实验

2.1　实验材料与动物

2.1.1 材料与试剂

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA, 75/25, M_w=118 kDa)购自德国赢创(Evonik)化工公司；单甲氧基聚乙二醇-外消旋聚乳酸共聚物(PELA, M_w=38 kDa)购自济南岱罡生物科技有限公司；聚乙烯醇(PVA)购自日本可乐丽株式会社；氯化钠、乙酸乙酯等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；尼罗红、FITC-SE (异硫氰酸荧光素)、Cy7-SE染料均购自北京泛博公司；牛血清白蛋白(BSA)、BCA (Bicinchoninic Acid)蛋白定量试剂盒购自Thermo Fisher公司；SARS-CoV-2 RBD抗原(新冠抗原)馈赠自安徽智飞龙科马生物制药有限公司；铝佐剂购自InvivoGen公司；ELISA蛋白包被液、终止液、TMB (3,3',5,5'-四甲基联苯胺)显色液、磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸盐吐温缓冲液(PBST)购自北京索莱宝生物科技有限公司；生化分析试剂盒购自Toshiba公司。

2.1.2 实验动物

BALB/c小鼠(6~8周龄)购自北京维通利华实验动物科技有限公司，饲养于中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室实验动物中心SPF级动物房。本研究严格按照《实验动物饲养管理条例》和《动物伦理审查指南》(GB/T35892-2018)进行。所有动物实验均由中国科学院过程工程研究所动物伦理委员会审查批准(批准号：IPEAECA2021051)。

2.2　实验设备与分析仪器

Digital Sonifier 450超声破碎仪(Branson公司)，T18高速均质机(IKA公司)，0003671000磁力搅拌器(IKA公司)，移液枪(Eppendorf公司)，HS-3垂直混悬仪(宁波新芝生物科技公司)，LA3108精密电子天平(Sartorius公司)，JSM-6700F扫描电子显微镜(SEM，JEOL公司)，EVOSFL光学显微镜(Thermo Fisher公司)，Mastersizer 2000激光粒度仪(Malvern公司)，Zetasizer Nano (Malvern公司)，Ti2超分辨激光共聚焦显微镜(CLSM，Nikon公司)，InfiniteM200酶标仪(TECAN公司)，IVIS小动物成像系统(Perkin Elmer公司)，AvantiJ-26XP高速离心机(Beckman Coulter公司)，ACCUTETBA-40FR全自动生化分析仪(Toshiba公司)。

2.3　实验方法

2.3.1 微球的制备

多孔PLGA微球的制备(在超净台中)：将180 mg的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)与20 mg的聚乙二醇-乳酸共聚物(PELA)溶于2 mL乙酸乙酯中(油相，O)，对于共聚焦显微镜观察的微球样品则同时加入少量尼罗红。然后向油相中加入0.5 mL的0.1wt%的氯化钠水溶液(内水相，W₁)，用超声破碎仪(超声2 s，停2 s，共6次)制备初乳液(油包水，W₁/O)，将初乳液倒入15 mL含1.5wt% PVA的水溶液(外水相，W₂)中，用均质机制备复乳液(水包油包水，W₁/O/W₂)，接着将复乳液倒入1000 mL超纯水中，室温下磁力搅拌2 h使溶剂挥发微球固化。10~30 μm筛网过筛后收集微球并置于4℃下保存备用。

实心PLGA微球的制备(在超净台中)：将200 mg的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)溶于2 mL乙酸乙酯中(油相，O)，将油相倒入15 mL含1.5wt% PVA的水溶液(水相，W)中，用均质机制备乳液(水包油，O/W)，随后将乳液倒入1000 mL超纯水中，室温下磁力搅拌2 h使溶剂挥发微球固化。10~30 μm筛网过筛后收集微球置于4℃下保存备用。

2.3.2 微球形貌观察

SEM：将PLGA微球溶液稀释至合适浓度，吸取少量微球悬液滴加至平整的锡箔纸上自然风干，将载有微球的锡箔纸用导电胶粘贴在样品台上，喷金后进样，观测微球表面形貌。

光学显微镜：将PLGA微球溶液稀释至合适浓度，吸取少量微球悬液滴加至载玻片上，将载有微球的载玻片置于显微镜物镜下，观测微球表面及内部形貌。

2.3.3 微球粒径与电势测定

将制备好的PLGA微球稀释至合适浓度，吸取适量微球悬液加入至激光粒度仪的样品池中，检测粒径分布及其表面电势。

2.3.4 多孔微球装载蛋白内部结构

取100 μL尼罗红标记的多孔微球与100 μL FITC标记的BSA蛋白溶液于垂直混悬仪中4℃下共混3天，离心后去除上清BSA溶液，置于激光扫描共聚焦显微镜下观察多孔微球装载蛋白后的内部结构。

2.3.5 多孔微球包埋率的测定

取20 mg多孔微球与100 μL系列浓度的BSA蛋白溶液于垂直混悬仪中4℃下共混3天，离心后吸取上清BSA溶液，洗涤2次后将洗涤液汇入上清液中，记录混合液体积，采用BCA法测定混合液中蛋白浓度。包埋率按式(1)进行计算：

(1)

式中，E为包埋率(%)，M为投入BSA质量(mg)，m为混合液中BSA质量(mg)。

2.3.6 多孔微球体外释放曲线的测定

取20 mg多孔微球与100 μL 6 mg/mL的BSA蛋白溶液于垂直混悬仪中4℃下共混3天，离心后吸取上清BSA溶液，洗涤2次后将洗涤液汇入上清液中，记录混合液体积。然后向微球中补加100 μL PBS后于37℃下静置，并于第1, 3, 6, 9, 12天离心吸取上清后再补加100 μL PBS。BCA法测定上清液中的BSA质量，计算微球中的BSA质量，以第0天微球中的BSA质量为最大值计算百分比。

2.3.7 抗原体内释放小动物成像

取10 μL 6 mg/mL的BSA-Cy7蛋白溶液与2 mg多孔微球于垂直混悬仪中4℃下共混3天后，离心后去除上清BSA溶液，作为多孔微球组(Porous组)；取10 μL 6 mg/mL的BSA-Cy7蛋白溶液与2 mg实心微球共混，作为实心微球组(Solid组)；取10 μL 6 mg/mL的BSA-Cy7蛋白溶液作为游离蛋白组(Free组)。将上述三组样品分别与50 μL生理盐水混合后，皮下注射至小鼠尾巴根部(小鼠数量n=3)，注射前先对小鼠尾部进行脱毛操作，通过耳标实现对单只小鼠的持续追踪监测。在不同时间点(0, 1, 3, 5, 10, 15天)利用小动物活体成像系统拍摄BSA-Cy7的荧光强度图片，以第0天的BSA-Cy7的荧光强度为最大值计算百分比。

2.3.8 小鼠免疫新冠抗原及血清取样

制备好的多孔微球与新冠抗原经过混悬装载，离心洗涤2次去掉游离抗原。离心后的上清汇集后，使用BCA法进行蛋白定量，再经过差值计算，得出微球中包埋的抗原总量。动物实验前根据抗原使用剂量，将包埋微球用PBS稀释到目标浓度，以得到含有10 μg抗原的疫苗工作液。取装载了10 μg新冠抗原的多孔微球作为多孔微球组(Porous组) ；将10 μg新冠抗原与等量实心微球共混，作为实心微球组(Solid组)；将10 μg新冠抗原与50 μg市售铝佐剂共混作为铝佐剂组(Al组)。将上述三组样品分别与50 μL生理盐水混合后，皮下注射至小鼠大腿根部(n=6)，初次免疫(W0)后的第2周进行二次免疫。分别在第1, 2, 4, 6, 9, 12, 16周进行眼眶取血，37℃孵育2 h凝血后离心获得血清。

2.3.9 血清抗体滴度测定

采用ELISA法对小鼠血清中抗原特异性IgG进行测定。配制抗原浓度为2 μg/mL的抗原包被工作液，每孔100 μL加入到高吸附的96孔板中，4℃过夜孵育。取出拍干孔内液体，加入200 μL 5wt% BSA溶液，37℃封闭2 h。取出拍干孔内液体，加入100 μL倍比稀释的待测血清，37℃孵育2 h。PBST洗涤5次后，加入100 μL HRP标记的小鼠二抗，37℃孵育0.5 h。PBST洗涤5次后，加入100 μL TMB检测底物，反应10 min后加入终止液。利用酶标仪检测吸光度，计算IgG抗体滴度。通过Origin软件对IgG滴度随时间变化曲线进行拟合，计算斜率变化，获得IgG滴度上升速度变化曲线。

2.3.10 血液生化检测

采用全自动生化分析仪对免疫后6周(W6)的血清进行检测，检测指标为尿素氮(Blood Urea Nitrogen, BUN)-肾功能、丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase, ALT)-肝功能、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)-肝功能、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase, AST)-肝功能、乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase, LDH)-心肌功能。将待测血清置于4℃下平衡，开机清洗仪器后，设置待测项目并进行质控，质控通过后进行检测。

2.3.11 统计学分析

除抗体滴度结果使用平均值±均值标准误差(Mean±SEM)表示，其余结果均用平均值±标准差(Mean±SD)表示，三组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)对数据进行统计学分析，两组间比较采用双尾非配对t检验对数据进行统计学分析。其中，P>0.05 (ns)表示不具有显著性差异，P<0.05 (*)表示具有显著性差异，P<0.01 (**), P<0.001 (***), P<0.0001 (****)表示极具显著性差异。

3 结果与讨论

3.1　实心与多孔微球的表征

为了证明PLGA微球的多孔结构(Porous)有助于提高微球在疫苗中的佐剂效果，利用相同的聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (PLGA, 75/25, M_w=118 kDa, 端酯基)，通过单次乳液形成方法，制备出具有实心结构(Solid)的PLGA微球作为对照组，考察PLGA多孔微球与实心微球在表面形貌、内部结构、粒径分布、表面电势上的区别与联系。

3.1.1 微球表面形貌与内部结构

与制备实心微球的单次乳化方法不同，由于制备多孔微球的复乳法的内水相(W₁)为具有一定盐离子浓度的氯化钠水溶液，而外水相(W₂)为不含盐离子的PVA水溶液，形成W₁/O/W₂复乳液滴的内外水相间产生一定强度的渗透压。在渗透压的作用下，内外水相的溶剂与溶质交换导致中间还未固化的PLGA油相(O)被冲出便于快速交换的贯通孔道。在此过程中，由于油相溶剂逐渐挥发，油相中PLGA的流动性降低，微球逐渐固化，这些孔道被保留下来，由此产生PLGA微球的多孔结构。通过扫描电子显微镜对PLGA实心与多孔微球的表面形貌进行表征。如图1(a)和1(b)所示，实心微球无论在低倍还是高倍下，均呈现光滑致密的表面结构；而如图1(c)和1(d)所示，多孔微球的表面则出现均匀分散的微小孔状结构。通过光学显微镜与激光共聚焦显微镜对PLGA实心与多孔微球的内部结构进行表征，如图2(a)和2(b)所示，实心微球的内部呈现均一的PLGA材料分布；而如图2(c)和2(d)所示，多孔微球的内部则呈现出大量互相连接的球形空腔。

图1 不同形貌微球的扫描电镜图

Fig.1 SEM images of microspheres with different morphologies

图2 不同形貌微球的内部结构表征

Fig.2 Characterizations of the internal structure of microspheres with different morphologies

3.1.2 微球的粒径与电势

颗粒的尺寸影响其负载抗原蛋白、诱导免疫反应的类型。纳米微球由于具有高比表面积，将抗原负载于颗粒表面装载效率更高；在相同佐剂质量下，微米级微球具有更大的内部装载空间，适合于将抗原装载到微球内部^[30]。与纳米微球往往通过受体介导的胞吞作用被摄取不同，粒径大于10 μm的微球可以避免被单核-巨噬系统吞噬^[31]，滞留在注射部位。通过激光粒度仪对PLGA实心与多孔微球的粒径进行表征，如图3(a)所示，过筛后的实心微球平均粒径为23.18±2.32 μm，多孔微球平均粒径为23.49±2.69 μm，两种结构的微球在粒径上基本一致。而对于表面电势[图3(b)]，实心微球与多孔微球的表面带有相近的净负电荷，分别为-20.13±1.84和-23.80±2.40 mV，并无显著性差异。所构建颗粒尺寸在10~30 μm之间，既可以避免被吞噬，更多滞留于注射部位，方便研究微球结构对抗原释放及后续免疫效应的影响；又避免使用过大尺寸的微球，从而满足常规注射需求。

图3 微球的 (a) 粒径分布与 (b) 电势

Fig.3 (a) Particle size distributions and (b) zeta potential of microspheres

3.2　多孔微球装载与释放抗原

制备出多孔PLGA微球后，由于其内部球形空腔的直径远大于其表面小孔结构的直径，有利于抗原的大量装载及缓慢释放，本节分别考察了多孔微球的抗原装载形态、装载效率与体外释放情况。

3.2.1 多孔微球装载抗原

通过向多孔微球的液体环境中加入高浓度蛋白溶液，配合垂直混悬仪加速液体流动，微球外部的蛋白分子通过多孔微球表面与内部的贯通孔道被动扩散至微球中，进行抗原装载。这种温和的抗原“后装载”技术可以极大程度地避免由于有机溶剂与机械力作用而导致的抗原表位丢失与蛋白降解。以BSA-FITC为模式抗原，通过激光共聚焦显微镜对尼罗红标记的PLGA多孔微球浸润、装载抗原情况进行表征。如图4(a)和4(b)所示，实心微球浸润抗原并洗涤后，微球上并未出现明显的绿色荧光，表明实心微球无法高效吸附抗原。多孔微球浸润抗原后[图4(c)]，红色多孔微球的外部与内部空腔均充满了绿色的抗原。并且由于抗原绿色荧光的存在，微球骨架的红色变成了橘黄色。洗去外部多余抗原后，继续对多孔微球内部球形空腔装载抗原的情况进行表征。如图4(d)所示，微球内部大部分球形空腔中的绿色抗原被保留，仅有少数靠近微球表面的空腔中的抗原被洗去。导致这种现象的原因可能是微球表面连通这些空腔的孔道过大，孔内外液体交换速度更快。

图4 多孔/实心微球浸润与装载抗原激光共聚焦显微镜图

Fig.4 CLSM images of solid/porous microsphere infiltrated or loaded with antigen

之后通过BCA法对BSA的装载进行定量分析[图5(a)]，在抗原浓度为5.71 mg/mL以内时，随着BSA投入浓度增加，多孔微球的抗原包埋率随之升稿，呈正相关趋势。考虑到较高蛋白浓度下抗原易于产生多聚体，为了保障实验准确性，本研究中所使用的抗原投入浓度最高为5.71 mg/mL。此时，抗原包埋率达到10.81%。虽然当前的多孔微球可以实现微球结构对免疫的影响的研究，微球包埋仍然有继续优化的空间。后续可以从微球结构出发提升包埋率：充分连通微球内部空腔，提高抗原浸润效率；愈合微球表面小孔，避免抗原渗漏，提升包埋率。

图5 多孔微球的 (a) 抗原包埋率与 (b) 体外释放曲线

Fig.5 (a) Encapsulation efficiency curve and (b) in vitro release curve of porous microspheres

3.2.2 多孔微球体外释放抗原

通过混悬仪加速被动扩散的方法使多孔微球装载抗原后，将微球在37℃下的PBS中静置，可一定程度模拟微球的体内释放，指导后续的抗原体内释放实验。如图5(b)所示，抗原从多孔微球中完全释放出来约需12天，前3天抗原释放速度较快，然后逐渐降低。导致这种现象的原因可能是抗原与微球之间存在如静电相互作用、疏水相互作用等的非特异性作用力，因此远离微球内腔表面的抗原释放速度较快，而距离内腔表面较近的抗原释放速度较慢。

3.3　微球结构对抗原体内释放速度的影响

以BSA-Cy7为模式抗原，通过小动物体内成像系统可以观察抗原在注射部位的滞留情况。本研究考察了装载抗原的多孔微球组(Porous)、与抗原共混的实心微球组(Solid)以及作为对照组的游离抗原组(Free)中抗原在注射部位滞留时间的区别，由此分析微球结构对抗原体内释放速度的影响。如图6(a)和6(b)所示，相对于刚注射时(D0)的荧光强度，注射后1天时(D1)游离蛋白组与实心微球组的相对平均荧光强度(Relative MFI，以下简称荧光强度)已经快速降低至15%以下，而多孔微球组仍有73.59%的荧光强度。注射后3天时(D3)，游离抗原组的抗原荧光已基本消失，实心微球组荧光强度已下降到6.89%，而多孔微球组仍有46.68%的荧光强度。导致实心微球组与游离抗原组差异的原因可能是蛋白与微球之间存在非特异性吸附，微球表面的蛋白释放速度减慢，与抗原的体外释放结果[图5(b)]一致。注射后5天时(D5)，实心微球组的抗原荧光也已基本消失，而多孔微球组荧光强度仍有24.43%。直至注射后15天时(D15)，多孔微球组抗原达到释放终点。以上结果表明，相对于游离蛋白与实心结构的微球，多孔结构的微球可以大大减缓抗原在体内的代谢速度，延长抗原在注射部位的滞留时间，增加抗原与机体的作用时间。

图6 不同结构微球对抗原体内滞留的影响：(a) 抗原在体内滞留的图像；(b) 相对MFI统计

Fig.6 Effects of microspheres with different structures on antigen retention in vivo: (a) images of antigen retention in vivo; (b) relative MFI statistics

3.4　微球结构对新冠疫苗免疫效果的影响

PLGA缓释微球具有增强树突状细胞、巨噬细胞等APCs摄取、激活与交叉提呈抗原的效果，提高疫苗的免疫效果^[32,33]。本研究通过装载或共混新冠抗原，构建了以多孔或实心PLGA微球为佐剂的新冠疫苗。以市售疫苗常用铝佐剂制备的疫苗组(Al)为参照，考察了新冠抗原混合实心微球疫苗组(Solid)、装载新冠抗原的多孔微球疫苗组(Porous)的免疫效果，探究了微球结构对新冠疫苗免疫效果的影响。如图7(a)所示，所有组别小鼠均接受2针次疫苗注射，以首次注射时间为W0，初次免疫后2周(W2)进行加强针免疫。期间通过眼眶取血获得小鼠血清，取血时间持续至初免后16周(W16)。

图7 (a) 小鼠免疫和采血方案；(b) 小鼠血清中抗原特异性IgG滴度-时间曲线；(c) 不同疫苗的IgG滴度上升率-时间曲线及抗体滴度变化

Fig.7 (a) Mouse immunization and blood collection procedures; (b) antigen specific IgG titer-time curves in mouse serum; (c) IgG titer rising rate-time curves of different vaccines

通过ELISA法对小鼠血清中抗原特异性IgG进行测定，获得疫苗W1~W16的IgG抗体滴度变化曲线，如图7(b)所示。虽然各组间IgG滴度变化呈现相似的变化趋势，均在4周左右时达到了抗体最高水平，然后开始逐渐下降，但是在抗体产生速度和滴度维持效果上仍有较大差异。考虑到第二次免疫后，除微球结构的影响外，免疫记忆的参与在二免后的抗体滴度上升中发挥重要作用。因此，一免之后到二免之前这个时间段内抗体滴度的变化，更直接反映了微球结构对抗体产生速度及滴度的影响。之前的研究表明，对于APCs的募集通常在微球注射后3天左右达到峰值^[32,34]。然而根据图6，实心微球组在第3天时仅有微量抗原滞留，与APCs的募集时间并不匹配，降低了抗原利用率；而多孔微球组在第3天时依然存在46.68%的抗原荧光强度，有利于APCs对抗原的大量摄取与提呈。由此，抗原释放与APCs募集的时空匹配度，是导致二免之前(W1, W2)多孔微球组与实心微球组抗体滴度出现明显差异[图7(b)]，即抗体产生速度不同的可能原因。

通过对ELISA法测定的三种疫苗W1~W16的小鼠血清中抗原特异性IgG抗体滴度变化曲线[图7(b)]进行非线性曲线拟合(拟合均收敛，达到1E-9的Chi-sqr容差值)，经过微分后，获得了小鼠血清中IgG上升速度随时间变化曲线[图7(c)]。血清中IgG的上升速度的变化可一定程度反映机体免疫反应的响应水平与起效快慢。如图7(c)所示，从IgG滴度上升速度最大值V_max上看，装载了新冠抗原的多孔微球疫苗组是新冠抗原混合实心微球疫苗组的1.73倍，是铝佐剂疫苗组的2.26倍；从IgG滴度上升速度达到最大值V_max的时间t上看，装载新冠抗原的多孔微球疫苗组比新冠抗原混合实心微球疫苗组提前了2.8天，比铝佐剂疫苗组提前了9.52天。以上结果表明，装载新冠抗原的多孔微球疫苗组的免疫响应水平更高，起效时间更早。如图7(c)所示，从第4周开始，三个疫苗免疫组均经过了IgG滴度上升速度达到最大值V_max的时间t，免疫反应趋于稳定或开始回落。因此，通过比较疫苗W6~W16的小鼠血清中IgG抗体滴度，可一定程度反映抗体滴度的维持效果。如图7(b)所示，在W6~W16期间，装载了新冠抗原的多孔微球疫苗组IgG抗体滴度均高于新冠抗原混合实心微球疫苗组。其中第12周时，多孔微球疫苗组IgG抗体滴度是实心微球疫苗组的3.4倍，P=0.0296(*)具有显著性差异。以上结果表明，相对于实心微球，装载新冠抗原的多孔微球疫苗组在免疫后具有更优维持抗体滴度的潜力。

3.5　多孔微球作为新冠疫苗佐剂的生物安全性

如图7(b)所示，免疫后到6周时，三个疫苗免疫组均经过了IgG滴度上升阶段。通过对此时的小鼠血清进行血液生化指标的检测，可以判断疫苗的注射是否引起小鼠即时的功能性病变。使用血液生化分析仪对小鼠血清里的LDH (心脏)、ALP (肝脏)、ALT (肝脏)、AST (肝脏)和BUN (肾脏)生化指标的含量进行检测。如图8所示，三组小鼠所有生化指标均在正常参考范围内(图中红线范围内)。装载了新冠抗原的多孔微球疫苗组、新冠抗原混合实心微球疫苗组、铝佐剂疫苗组与健康小鼠对照组之间所有指标均无显著性差异，说明不论是多孔还是实心PLGA微球均未对小鼠的心、肝、肾功能产生即时的功能性损伤。以上结果表明，本实验制备的PLGA多孔微球作为疫苗佐剂未对小鼠产生毒性反应，具有良好的生物安全性。

图8 免疫后6周小鼠血液生化指标

Fig.8 Blood biochemical indices in mice after 6 weeks by immunization

4 结论

为了验证多孔结构的微球在新冠疫苗中的佐剂效果，本研究以类似的乳化方法制备了PLGA多孔微球与实心微球，从微球形貌结构、抗原装载、抗原释放、新冠疫苗佐剂效果、佐剂生物安全性等方面，对PLGA多孔微球提升新冠疫苗免疫水平的效果进行了分析与评价，得出以下结论：

(1) PLGA多孔微球与实心微球相比，多孔微球在形貌上具有内部空腔和表面小孔的独特结构，而两种微球在微球粒径、表面电势上均无显著区别。

(2) PLGA多孔微球内部球形空腔直径远大于其表面小孔直径的特征，有利于抗原的大量装载与缓慢释放。抗原投入浓度5.71 mg/mL时的抗原包埋率达到10.81%，且与抗原投入浓度呈正相关；体外释放终点达到12天。

(3) PLGA多孔微球可以大大减缓抗原在体内的代谢速度，延长抗原在注射部位的滞留时间，增加抗原与机体的作用时间。相对于游离抗原在注射部位3天的滞留终点，和实心微球混合抗原5天的滞留终点，多孔微球对于装载到球内的抗原的缓释作用将滞留终点延长至15天。

(4) 与实心微球混合新冠抗原的疫苗组相比，装载新冠抗原的PLGA多孔微球疫苗组的IgG滴度上升速度最大值V_max是其1.73倍，响应水平更高；达到IgG滴度上升速度最大值V_max的时间t比其提前了2.8天，起效时间更早；疫苗接种后6~16周期间，IgG抗体滴度均高于实心微球组，具有更优维持抗体滴度的潜力。

略

Porous PLGA microsphere as a vaccine adjuvant against COVID-19

Lingjiao ZOU ^1,² Yu ZHANG ^2,³Hua YUE ^2,³ Guanghui MA ^1,^2,³

1. Division of Molecular Science, Graduate School of Science and Technology, Gunma University, Gunma 376-8515, Japan
2. State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China
3. School of Chemical Engineering, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Abstract: Poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA) nano-/microspheres have been proven to be effective as vaccine adjuvants. In current studies, the investigations on PLGA vaccine delivery microspheres have mainly focused on improving antigen loading/adsorption efficiency or co-delivery of multiple adjuvants to enhance the immunization effect. However, there is still a lack of discussion on the impact of the structural diversity of microspheres in promoting the vaccination effects. By rationalizing the design of the microsphere structure, we describe that the development of an effective SARS-CoV-2 vaccine adjuvant was achieved by the post-loading of SARS-CoV-2 antigen into porous PLGA microspheres, which provided non-destructive loading and prolonged release of antigen. In this work, PLGA porous microspheres and solid microspheres were prepared with the emulsification method, and there was no significant difference in microsphere particle size and surface potential between the two, except for the porous microspheres having cavities internally and tiny pores on the surface. Such characteristics of "large inner pores and tiny outer pores" enabled the antigen encapsulation efficiency to reach 10.81% at the antigen input concentration of 5.71 mg/mL. In terms of prolonging the in vivo retention of the antigen, the release endpoint in the antigen-loaded porous microspheres was prolonged to 15 days compared with that of the free antigen at 3 days and that of the solid microsphere-mixed antigen at 5 days. Concerning the enhancement of humoral immunization, compared with the solid microsphere vaccine group mixed with SARS-CoV-2 antigen, the porous microsphere vaccine group loaded with SARS-CoV-2 antigen had a higher onset of effect as the maximum value of the IgG titer rising rate, V_max was 1.73 times higher; and the onset of effect was much earlier, as the time to reach the V_max was 2.8 days earlier; also, the IgG antibody titer of which was higher during 6~16 weeks post-immunization, presenting a better antibody maintenance effect.

Keywords: PLGA microspheres；porous microspheres；antigen loading；SARS-CoV-2 vaccine adjuvant

引用本文：邹龄娇, 张瑜, 岳华, 等. 多孔PLGA微球作为新型冠状病毒疫苗佐剂的研究. 过程工程学报, 2024, 24(3): 360-370. (Zou L J, Zhang Y, Yue H, et al. Porous PLGA microsphere as a vaccine adjuvant against COVID-19 (in Chinese). Chin. J. Process Eng., 2024, 24(3): 360-370, DOI: 10.12034/j.issn.1009‑606X.223218.)

作者简介：邹龄娇，博士研究生，材料与生命科学专业，E-mail: zoulingjiao123@163.com；

作者简介：岳华，特聘青年研究员，研究方向为新型纳微米颗粒在疫苗佐剂和肿瘤免疫中的应用，E-mail: hyue@ipe.ac.cn

中图分类号： Q819

文章编号：1009-606X(2024)03-0360-11

文献标识码： A

收稿日期：2023-08-06

修回日期：2023-09-27

出版日期：2024-03-28

网刊发布日期：2024-04-03

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过程工程学报

《过程工程学报》(月刊)创刊于1976年，由中国科学院过程工程研究所主办、科学出版社出版。《过程工程学报》以过程工程科学为学科基础，重点刊登材料、化工、生物、能源、冶金、石油、食品、医药、资源及环境保护等领域中涉及过程工程的原创论文。

​邹龄娇, 张瑜, 岳华, 等丨多孔PLGA微球作为新型冠状病毒疫苗佐剂的研究

1 前 言

2 实 验

2.1 实验材料与动物

2.2 实验设备与分析仪器

2.3 实验方法