周悦, 王玉, 曹雷鹏, 等丨旋藻培养液高效循环利用及其生长抑制因子的鉴定

文摘 2024-06-07 15:27 北京

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螺旋藻培养液高效循环利用及其生长抑制因子的鉴定

周悦 ¹ 王玉 ¹曹雷鹏 ^1,² 刘玉环 ¹ 樊瑞娟 ¹黄正花 ³温子轩 ¹

1. 南昌大学生物质转化教育部工程研究中心，食品科学与资源挖掘全国重点实验室，江西南昌 330047
2. 江西中医药大学院士工作站，江西南昌 330004
3. 江西省农业科学院农产品质量安全标准研究所，江西南昌 330200

DOI：10.12034/j.issn.1009-606X.223192

摘要针对螺旋藻培养耗水量大、成本较高、营养元素浪费严重且其培养液循环利用过程中生长受到严重抑制等问题。本工作采用0.45 μm滤膜、10 kDa超滤膜、大孔树脂S-8和活性炭处理螺旋藻培养液，评估处理后的培养液循环利用5次后，螺旋藻的生长及营养成分含量变化，并分析鉴定胞外抑制的组成成分。结果表明，螺旋藻培养液的处理可有效降低胞外有机物的抑制效果，其处理效果顺序为10 kDa超滤膜>大孔树脂S-8>活性炭>0.45 μm滤膜。培养液循环利用5次后，10 kDa超滤膜处理组的螺旋藻细胞干重仅下降5.9%，而0.45 μm滤膜处理组的细胞干重显著降低22% (p<0.05)，且由于细胞代谢的胁迫作用，其胞内多糖含量却增加了217%。此外，培养液中的胞外抑制物主要是由岩藻糖(19.98%)、鼠李糖(15.61%)和葡萄糖(14.75%)等单糖组成的多糖类有机物。

关键词螺旋藻；循环利用；超滤；藻蓝蛋白；胞外多糖

1 前言

螺旋藻(Spirulina platensis)是由单细胞组成的螺旋丝状蓝绿色原核生物，富含蛋白质、多糖和维生素等多种营养功能生物活性物质，如藻蓝蛋白、必需氨基酸、多糖、叶绿素及维生素等^[1-3]，且各种成分均有一定的生物活性功能(如抗氧化、提高免疫力、抗炎症、抗肿瘤等)，同时螺旋藻对于调整肠道菌群结构、改善肠道微生态环境也具有重要作用^[4,5]。螺旋藻及其提取物广泛应用于医药、食品、饲料及化妆品等领域，被联合国粮食及农业组织(FAO)和世界食品协会誉为“21世纪最佳营养源”，具有广阔的应用前景^[6-8]。目前，螺旋藻属有50多种，其中极大螺旋藻和钝顶螺旋藻具有光合作用强、生长繁殖速度快、环境适应能力强和容易采收等特点，是国际上为数不多的可大规模人工培养的微藻。螺旋藻营养成分丰富且均衡，富含多种生物活性物质，是一种具有极高经济价值的藻类，90%以上的螺旋藻都被用作膳食营养补充剂及医药添加剂^[9]。

目前，螺旋藻培养采用最广泛的培养基为Zarrouk培养基，跑道式培养是目前微藻产业化生产过程中主要的培养方式，具有能耗低、简单易操作等优点，然而螺旋藻培养需要大量水来维持细胞生长和悬浮营养物质^[10]，每1 kg干生物质约需要200 kg淡水来维持螺旋藻的培养，耗水成本占总成本的50%以上^[11]。此外，螺旋藻培养液含有大量的营养盐且pH较高，若直接排放会导致水资源严重浪费且污染生态环境，因此，降低螺旋藻的耗水成本并避免环境污染刻不容缓^[12]。近年来，研究发现螺旋藻培养液会残留溶解性有机物(多糖、蛋白等)、细胞碎片和微生物等物质，会严重影响螺旋藻的产量及营养质量^[13,14]。Depraetere等^[11]于2015年报道了螺旋藻在生长过程中会释放对自身生长有抑制作用的藻类有机物(Algal Organic Matter, AOM)。因此，降低AOM在螺旋藻培养液中的负面影响是螺旋藻产业可持续发展面临的关键问题^[15]。

针对螺旋藻大规模培养过程耗水量大、成本高、营养元素浪费严重且产生自我抑制的藻类有机物等问题，本工作拟探明螺旋藻培养过程中抑制藻自身生长的主要物质。采用0.45 μm滤膜、10 kDa超滤膜、S-8大孔树脂及活性炭处理螺旋藻培养液，明确处理的培养液循环利用5次后螺旋藻生长、营养成分含量及培养液中抑制物含量的变化，优化处理条件及循环次数，以降低螺旋藻的耗水量及培养成本，提高螺旋藻的产量及品质，同时分析测定培养液中胞外抑制物的特性及其组成成分，为螺旋藻产业的绿色高效经济持续发展提供理论依据和技术支撑。

2 实验

2.1　材料与试剂

钝顶螺旋藻藻种(Spirulina platensis, GY-D18)为南昌大学国家实验室生物质转化中心自主保藏，培养基为Zarrouk培养基^[16]，并将其置于高压灭菌锅中121℃灭菌20 min，冷却至室温备用。

2.2　实验设备

水样荧光Water PAM(EDEE-0276，德国WALZ公司)，紫外可见分光光度计(UV-9000，上海元析仪器有限公司)，照度计(TES-1339，泰仕电子工业股份有限公司)，超声细胞粉碎仪(JY96-IIN，宁波新芝生物科技股份有限公司)，微型切向流膜过滤设备(GCM-FT-01，国初科技厦门有限公司)，傅里叶红外光谱仪(FTIR，Nicolet iS5，美国Thremo Fisher有限公司)，离子色谱仪(ICS-2500，美国Dionex公司)。

2.3　实验方法

2.3.1 培养液处理及循环方法设计

在500 mL锥形瓶中加入300 mL灭菌后的Zarrouk培养基，接种螺旋藻使初始吸光度A₅₆₀为0.3。锥形瓶置于25±1℃恒温培养室内，光照强度保持在5500 Lux。培养7天为一个周期，采用500目(29.96 μm)筛网收获螺旋藻，收获藻体后冻干，用于后续实验。收获藻细胞后，按以下四种处理方法对培养液进行处理，处理后的培养液重新用于培养第二批螺旋藻，共重复利用5个周期。每培养一批后根据各无机盐的消耗情况，补加至原有浓度。四种培养液处理方式如下：

(1) 0.45 μm滤膜处理：收获藻细胞的培养液去除藻丝后，采用0.45 μm滤膜进行过滤，用于后续的循环利用。

(2) 10 kDa超滤处理：收获藻细胞的培养液去除藻丝后，采用10 kDa超滤膜进行过滤后，用于后续的循环利用。

(3) 大孔吸附树脂S-8预处理^[17]：大孔树脂S-8依次经过95vol%乙醇、3wt% NaOH、4vol% HCl浸泡6 h后用水冲洗至中性，按0.1 g/mL湿重加入去藻丝的培养液中振荡2 h，静置24 h，滤出培养液，用于后续的循环利用。

(4) 活性炭预处理：活性炭用95vol%乙醇浸泡后，用水冲洗，循环直至醇洗不再产生浑浊后，按0.1 g/mL湿重加入去藻丝的培养液中振荡2 h，静置24 h，滤出培养液，用于后续的循环利用。

2.3.2 螺旋藻干重测定

通过计算培养过程中螺旋藻干重的变化评估螺旋藻类生长状况，绘制标准曲线为Y=0.3318A₅₆₀+0.1827 (R²=0.9973)，将螺旋藻干重与对照组比较，计算出螺旋藻的生长速率，用于判断不同循环培养方式中藻类的生长效果。

2.3.3 叶绿素荧光活性

采用水样荧光仪测定螺旋藻体内叶绿素荧光活性参数，协同叶绿体光系统II (PSII)的最大荧光量子效率Fv/Fm^[18]，评价循环培养液对螺旋藻的生长的影响。测量前，将3.0 mL样品置于黑暗处，处理15 min，使PSII反应中心完全氧化。

2.3.4 胞内外多糖含量测定

多糖含量采用苯酚-硫酸法^[19]进行测定。以标准葡萄糖的质量浓度为纵坐标，测定溶液490 nm的吸光度为横坐标，并绘制标准曲线为Y=0.1218A₄₉₀-0.0071 (R²=0.9934)。

螺旋藻胞内多糖(Intracellular Polysaccharide, IPS)测定：取螺旋藻培养液4.0 mL于8000 r/min离心10 min，将沉淀洗涤3次，定容至4.0 mL，在冰浴条件下超声破碎细胞10 min，8000 r/min离心10 min后收集上清液，采用苯酚-硫酸法测定其多糖含量，实验重复三次取平均值。将螺旋藻胞内多糖含量与对照组进行比较，计算出螺旋藻胞内多糖的增长率。

Growth rate=[(IPS_sample-IPS_control)/IPS_control]×100%

(1)

式中，Growth rate为螺旋藻胞内多糖的增长率(%)，IPS_sample和IPS_control为实验组和对照组螺旋藻胞内多糖含量。

胞外多糖(Exopolysaccharides, EPS)测定：取螺旋藻培养液4.0 mL于8000 r/min离心10 min，取上清液，透析袋透析48 h，采用苯酚硫酸法测定胞外多糖的含量，计算公式同式(1)，实验平行重复三次。

2.3.5 水溶性蛋白及藻蓝蛋白含量

水溶性蛋白(Water Soluble Protein, WSP)定量参考Bradford^[20]的方法。以牛血清标准蛋白浓度为纵坐标，于595 nm处检测溶液的吸光度(A₅₉₅)为横坐标，绘制出标准曲线为Y=255.37A₅₉₅+2.437 (R²=0.9952)。样品测定：细胞破碎同2.3.4节，8000 r/min离心10 min后收集上清液，用考马斯亮蓝方法测定其吸光度值，实验平行测定三次。螺旋藻内藻蓝蛋白用紫外分光光度计测定。称5 mg冻干后的螺旋藻生物质，用磷酸盐缓冲液溶解，超声细胞破碎10 min，8000 r/min离心10 min后收集上清液，分别测定562, 620及652 nm的紫外吸光度。藻蓝素(PCB)、别藻蓝素(APC)、藻红素(PEB)和藻蓝蛋白(PC)的浓度根据以下公式计算：

C_PCB=0.187×A₆₂₀-0.089×A₆₅₂

(2)

C_APC=0.196×A₆₅₂-0.041×A₆₂₀

(3)

C_PEB=0.104×A₅₆₂-0.251×C_PCB-0.088×C_APC

(4)

C_PC (mg/g)=[(C_PCB+C_APC+C_PEB)×V×100]/(m×1000)

(5)

式中，C为各物质浓度(mg/mL)，A₅₆₂, A₆₂₀和A₆₅₂分别为562, 620和652 nm处的紫外吸光度值，m为样品质量(g)，V为样品体积(mL)。

2.3.6 光合色素分析

叶绿素a (Chlorophyll a, Chl-a)和类胡萝卜素(Carotenoid)含量采用紫外可见分光光度计测定。每隔一天离心收获螺旋藻细胞，并用去离子水清洗三次，去掉上清液，加入甲醇，在冰浴条件下超声细胞破碎10 min，4℃避光过夜，提取液通过8000 r/min离心5 min后，测定上清液在470, 665.2, 652.4 nm的紫外吸光度，并根据公式(6)和(7)计算叶绿素a和类胡萝卜素含量。

C_Chl-a=16.72×A_665.2-9.16×A_652.4

(6)

C_Carotenoid=(1000×A₄₇₀-1.63×C_Chl-a)/221

(7)

式中，A_665.2, A_652.4, A₄₇₀分别是样品在665.2, 652.4和470 nm处的紫外吸光度。

2.3.7 胞外多糖的表征及成分分析

FTIR分析：1.0 mg干燥样品与100 mg KBr晶体在研钵中充分研磨，压制成片，将其置于4000~400 cm^-1的波长范围内进行光谱扫描，分辨率为4 cm^-1，扫描64次。

胞外多糖组成高效液相色谱(HPLC)分析：精密称取样品1.0 mg至10 mL安瓿瓶中，加入5.0 mL 4 mol/L三氟乙酸于10 mL安瓿瓶中，110℃下酸解2 h后，氮气吹干三氟乙酸，配置浓度为1.0 mg/mL的多糖溶液，吸取250 L样品溶液衍生。HPLC分析条件为：30℃柱温、1.0 mL/min流速、250 nm检测波长、20 L进样量，流动相为0.05 mol/L KH₂PO₄溶液(pH=6.0~7.0)-乙腈^[21]。

2.3.8 胞外多糖的抑制效果实验

将分离提取的胞外多糖粉末添加至200 mL新鲜螺旋藻培养液中，胞外多糖浓度分别为0, 15, 30, 45, 60 mg/L，培养10 d，每组三个平行样，持续光照强度和温度分别保持1800 Lux和25±1℃，湿度保持在65%左右，每天定时取样并测定螺旋藻的pH值及在560 nm下的吸光度，观察不同浓度的胞外多糖水溶液对螺旋藻生长抑制情况，培养周期为8 d。将藻细胞干重(DCW)与对照组进行比较，计算螺旋藻细胞的生长抑制率(GI)作为多糖水溶液的毒性指标^[21]：

GI=[(DCW_control-DCW_sample)/DCW_control]×100%

(8)

式中，DCW_control和DCW_sample分别是螺旋藻细胞对照组和实验组的干重。

2.3.9 数据处理

以上实验均重复三次，结果为MeanStd。采用Excel 2010和SPSS进行显著性分析和方差分析，Origin 8.0制图，p<0.05为数据显著性差异。

3 结果与讨论

3.1　螺旋藻产率及干重的变化

螺旋藻在循环培养过程中，其产率及生物量积累易受胞外有机物的持续抑制，本工作以细胞浓度及生长速率衡量螺旋藻细胞生长的状况^[22]。图1显示了0.45 μm滤膜、10 kDa超滤膜、大孔树脂S-8和活性炭四种方法处理培养液后，5次循环培养过程中螺旋藻产率及干重的变化。结果表明，螺旋藻在经过四种方法处理后的培养液中进行5次循环培养时，随培养液利用次数增加，螺旋藻细胞干重逐渐减少，其主要原因在于自身产生的胞外抑制物、轮虫及死亡的藻细胞等^[23,24]。图1(a)表明在0.45 μm滤膜的处理下，螺旋藻每次循环培养第八天时，最终细胞干重由第0次循环培养时的1.52 g/L降至第5次循环培养时的1.17 g/L，降低了约22%。图1(b)显示经过10 kDa超滤膜处理后，循环次数对螺旋藻细胞干重影响无显著性差异(p>0.05)，除第八天和第一天，产率均保持在0.2 (g/L)/d以上，第5次循环处理后培养8 d，螺旋藻细胞干重达到1.50 g/L，与新鲜培养液(第0次)所得螺旋藻细胞干重1.52 g/L，无显著性差异(p>0.05)，这可能是由于10 kDa滤膜可有效去除培养液中的胞外抑制物，降低其对藻细胞的抑制作用。培养液经大孔树脂S-8循环处理5次后培养螺旋藻8 d，其藻细胞干重比新鲜培养基减少了8.6% [图1(c)]。相比于10 kDa超滤膜处理方式，培养液经活性炭处理效果较差，处理5次后培养螺旋藻细胞干重比新鲜培养液下降了12.2% [图1(d)]。

图1 培养液处理及其循环培养对螺旋藻细胞生长及细胞干重的影响：(a) 0.45 μm滤膜；(b) 10 kDa超滤膜；(c) S-8大孔树脂；(d) 活性炭Fig.1 Effects of culture medium treatment and cyclic culture on cells growth and yield of S. platensis: (a) 0.45 μm filter membrane; (b) 10 kDa ultrafiltration membrane; (c) S-8 macroporous resin; (d) activated carbon

螺旋藻培养液经过0.45 μm滤膜处理后，去除了细胞残体等颗粒物，但循环后最终螺旋藻细胞干重与对照组相比仍下降，说明培养液中存在可溶解性的物质，抑制螺旋藻生长。这种减少的原因可能是培养基中胞外有机物产量增加，主要是螺旋藻在重复使用的培养基中释放胞外有机物，如多糖、蛋白等物质^[11]。Andrade等^[18]研究表明，将Zarrrouk培养基重复培养螺旋藻4个周期，培养液未经额外处理，且培养过程中未补充营养盐，螺旋藻产量在第4个周期与对照组相比降低50%。本实验中添加营养盐，经过0.45 μm滤膜的培养液所得螺旋藻干重下降了22%，经过10 kDa超滤膜和大孔树脂处理后培养，螺旋藻干重分别下降了5.9%和8.6%。结果表明10 kDa超滤膜可有效去除胞外物质，从而降低其对螺旋藻细胞生长的抑制，螺旋藻培养液经10 kDa超滤膜处理后进行循环培养具有较大的可行性。

3.2　荧光活性分析

荧光活性是分析光合作用系统的生理状态和监测藻类生物量的重要工具之一^[25-27]。图2显示四种方法处理培养液后经5次循环培养螺旋藻的荧光活性。由图2(a)和2(d)可知，培养液分别经0.45 μm滤膜和活性炭处理，5次循环培养螺旋藻8 d后，藻细胞活性Fv/Fm值由0.51分别降低至0.36和0.35，降低了29%~30%。经0.45 μm滤膜和活性炭处理之后的培养液培养得到的螺旋藻Fv/Fm较新鲜培养液明显下降，大多数处于0.3~0.4之间，螺旋藻细胞处于应激状态。图2(b)和2(c)显示10 kDa超滤膜和S-8大孔树脂处理后Fv/Fm值由0.51均降低至0.47，略低于新鲜培养液0.51，但远高于0.45 μm滤膜和活性炭处理组，说明在一定程度上，S-8大孔树脂和10 kDa超滤膜可去除培养基中螺旋藻胞外分泌抑制物，减轻螺旋藻细胞生长压力^[24,25]。Fv/Fm值下降，证明螺旋藻胞外分泌物抑制了细胞的光系统II (PSII)的生理状态，从而抑制细胞生长。该结果与3.1节所得的结果一致，Depraetere等^[11]也发现，循环使用的培养基中螺旋藻的Fv/Fm值比新鲜培养基的下降约50%。

图2 培养液处理及其循环培养对螺旋藻荧光活性的影响：(a) 0.45 μm滤膜；(b) 10 kDa超滤膜；(c) S-8大孔树脂；(d) 活性炭Fig.2 Effects of culture medium treatment and cyclic culture on fluorescence activity of S. platensis: (a) 0.45 μm filter membrane; (b) 10 kDa ultrafiltration membrane; (c) S-8 macroporous resin; (d) activated carbon

3.3　螺旋藻胞内多糖含量

胞内多糖(IPS)是目前螺旋藻中研究最多的功能活性物质之一，具有提高免疫、抗肿瘤、抗氧化等生物活性功能^[28]。图3显示了培养液处理及其5次循环利用过程中螺旋藻胞内多糖含量的变化。结果表明螺旋藻胞内多糖含量随着循环次数增加而逐渐增加，说明螺旋藻培养液循环培养过程有利于胞内多糖的积累。由图3可知，在循环培养5次后，采用0.45 μm滤膜处理后的一组，螺旋藻胞内多糖含量由54.7 mg/L显著增加至173.0 mg/L (p<0.05)，增加了约217%；活性炭次之，由54.7 mg/L增加至133.1 mg/L，增加了约144%；经过S-8大孔树脂处理后，胞内多糖含量增加至104.2 mg/L，增加了约91%；在10 kDa超滤膜处理后，螺旋藻胞内多糖含量由54.7 mg/L增加至86.0 mg/L，仅增加了57%，第4、5次循环过程中胞内多糖含量并无显著性差异(p>0.05)，该结果与Fv/Fm值变化相反，表明螺旋藻在受抑制条件下有助于积累胞内多糖。

图3 培养液处理及其循环培养对螺旋藻IPS含量的影响：(a) 0.45 μm滤膜；(b) 10 kDa超滤膜；(c) S-8大孔树脂；(d) 活性炭(a~f：图中不同字母表示显著性差异p<0.05)Fig.3 Effects of culture medium treatment and cyclic culture on IPS contents of S. platensis: (a) 0.45 μm filter membrane; (b) 10 kDa ultrafiltration membrane; (c) S-8 macroporous resin; (d) activated carbon (a~f: different letters showed significant difference p<0.05)

Yu等^[29]对栅藻和小球藻进行循环培养，发现胞内多糖物质含量发生了同样的变化，在不良培养条件下，栅藻和小球藻在循环培养中更容易积累胞内多糖。微藻的胞内多糖具有抗氧化活性，可参与保护藻类细胞免受氧化应激，因此，螺旋藻胞内多糖含量增加，原因可能是用于保护细胞，应对氧化应激反应^[30,31]。通过测量光系统II Fv/Fm最大量子产率，证实了循环培养的螺旋藻处于应激状态，在第二次循环后，微滤处理与活性炭处理的量子产率显著下降，而超滤处理与大孔树脂处理的量子产率相对稳定。

3.4　螺旋藻可溶性蛋白及藻蓝蛋白含量

螺旋藻被认为是最有价值的高蛋白质来源，其中藻蓝蛋白(Phycocyanin)是一种天然可食用功能性蓝色蛋白，在医药、食品及工业等领域均具有广泛的应用前景^[26]。图4显示了四种方法处理后循环培养5次对螺旋藻水溶性蛋白(WSP)及藻蓝蛋白含量的影响。结果表明，螺旋藻胞内水溶性蛋白及藻蓝蛋白含量随着循环次数增加而逐渐减少，只有10 kDa滤膜处理后培养的第4次、第5次，WSP及藻蓝蛋白含量升高。由图4(a)可知，在5次循环培养后，通过0.45 μm滤膜处理的培养液所得的螺旋藻WSP含量降低最多，由117.2 mg/g减少至58.2 mg/g，减少了约50%，藻蓝蛋白含量由18.5 mg/g显著减少至8.0 mg/g (p<0.05)，减少了约56%；活性炭次之，WSP减少了约48%，藻蓝蛋白减少了约56% [图4(d)]；经过S-8大孔树脂处理，在5次循环后，水溶性蛋白减少了27%，藻蓝蛋白减少了41% [图4(c)]；经10 kDa超滤膜处理后WSP含量减少幅度最小，约减少15%，且只有10 kDa滤膜处理后的第4和5次，WSP及藻蓝蛋白含量有所升高[图4(b)]。藻细胞蛋白含量减少可能是由于培养基条件发生变化，影响生物质生长活性，从而影响蛋白质合成积累。Castrillo等^[32]发现螺旋藻细胞中的蛋白质含量随氮供应速率的增加而增加。在本研究中，重复使用的培养基补充了营养素，因此，培养基中的氮含量都是相同的，所以螺旋藻蛋白质含量降低不应是由于氮元素减少造成的。也有研究^[33]表明，在循环过程中蛋白质含量下降，可能是因为螺旋藻胞外分泌物吸附在藻细胞表面，影响了其对营养物质的吸收。

图4 培养液处理及其循环培养对螺旋藻水溶性蛋白及藻蓝蛋白含量的影响：(a) 0.45 μm滤膜；(b) 10 kDa超滤膜；(c) S-8大孔树脂；(d) 活性炭(a~e: 图中不同字母表示显著性差异p<0.05)Fig.4 Effects of culture medium treatment and cycle culture on the WSP contents and phycocyanin in cell of S. platensis: (a) 0.45 μm filter membrane; (b) 10 kDa ultrafiltration membrane; (c) S-8 macroporous resin; (d) activated carbon (a~e: different letters showed significant difference p<0.05)

3.5　光合色素分析

螺旋藻细胞生长依赖的主要光合色素有叶绿素a、类胡萝卜素等，因此光合色素含量的变化可有效反映藻细胞的生长状况。图5显示了4种方法处理培养液后5次循环利用所得螺旋藻光合色素的变化。结果显示，螺旋藻叶绿素a及类胡萝卜素含量在每次循环后均逐渐减少。图5(a)表明采用0.45 μm滤膜处理后所得的螺旋藻叶绿素a含量减少最多，经过5次循环利用后减少约74%，螺旋藻类胡萝卜素含量由1.05 mg/g减少至0.96 mg/g，减少了约8%。图5(b)显示经10 kDa滤膜处理后，叶绿素a循环5次后其含量比对照组减少约5%，类胡萝卜素减少了约0.7%。图5(c)表明在S-8大孔树脂处理后，叶绿素a含量基本稳定在3 mg/g，减少率在6%左右；类胡萝卜素在5次循环后，减少了1.8%；由图5(d)可知活性炭处理5次循环之后，叶绿素a减少约30%，效果远不及10 kDa滤膜与S-8大孔树脂，类胡萝卜素减少了1.9%。与螺旋藻胞内其他营养素相比，在5次循环过程中，经大孔树脂与10 kDa超滤膜处理叶绿素a的损失较小，无显著差异性(p>0.05)；而未经处理则损失较大，证明超滤处理与大孔树脂处理可有效减轻循环培养中培养基成分改变对叶绿素a积累的影响。该结果与Depraetere等^[11]报道的结论一致，在新鲜培养基和循环使用的培养基中，类胡萝卜素含量变化最小，较其他营养素来讲，培养液的循环使用对类胡萝卜素含量影响最小，且经10 kDa超滤膜与S-8大孔树脂处理后，仅减少1%~2%。

图5 培养液处理及其循环培养对螺旋藻叶绿素a及类胡萝卜素含量的影响：(a) 0.45 μm滤膜；(b) 10 kDa超滤膜；(c) S-8大孔树脂；(d) 活性炭(a~e：图中不同字母表示显著性差异p<0.05)Fig.5 Effects of culture medium treatment and cycle culture on chlorophyll a and carotenoid content of S. platensis: (a) 0.45 μm filter membrane; (b) 10 kDa ultrafiltration membrane; (c) S-8 macroporous resin; (d) activated carbon (a~e: different letters showed significant difference p<0.05)

3.6　培养液中胞外多糖含量

胞外多糖(EPS)是螺旋藻细胞生长过程中分泌的一种自我保护性物质，其分泌量与外界培养环境密切相关^[32]。图6显示了螺旋藻循环培养过程中胞外多糖含量的变化。如图6(a)所示，在0.45 μm滤膜处理下，由于0.45 μm滤膜不能截留掉多糖，螺旋藻培养基中胞外多糖在前两次循环中不断累积，最高达52.6 mg/L，在后3次循环中胞外多糖反而逐渐减少，这可能是由于培养基中螺旋藻胞外分泌物抑制了生物质生长，从而影响螺旋藻正常代谢，使多糖分泌减少^[33]；也有可能螺旋藻在生长过程中，细胞利用环境中的碳水化合物，从而使胞外多糖含量减少。培养液中多糖含量最后逐渐稳定，这可能是因为培养液中存在的螺旋藻胞外分泌物抑制了螺旋藻生长，从而影响螺旋藻正常生理代谢，导致培养基中多糖增长量减少，趋于稳定^[34,35]。

图6 培养液处理及其循环培养对螺旋藻培养液中胞外多糖含量的影响：(a) 0.45 μm滤膜；(b) 10 kDa超滤膜；(c) S-8大孔树脂；(d) 活性炭Fig.6 Effects of culture medium treatment and cycle culture on extracellular polysaccharide contents in culture medium of S. platensis: (a) 0.45 μm filter membrane; (b) 10 kDa ultrafiltration membrane; (c) S-8 macroporous resin; (d) activated carbon

如图6(b)~6(d)所示，每次培养结束后，经10 kDa超滤膜、S-8大孔树脂、活性炭处理后会截留掉部分多糖，培养液中多糖含量在一定程度上减少。经超滤处理后，5次循环中培养液中多糖含量平均减少63.4%，S-8大孔树脂减少43%，活性炭减少32.7%。与上述结果相同，在胞外多糖减少最多的实验组，螺旋藻生长情况最好，胞内营养物质损失最小，且所得产量最大。

3.7　胞外多糖的抑制效果验证

文献[36]报道胞外多糖对螺旋藻细胞生长具有一定的抑制作用。图7(a)显示螺旋藻培养前4 d，胞外多糖浓度(0~60 mg/L)对螺旋藻的生长无显著性差异，其主要原因可能是螺旋藻正处于适应期阶段，超过4 d后，随着胞外多糖浓度的增加，其抑制率逐渐增加，导致螺旋藻细胞生长速率显著下降(p<0.05)。在培养8 d后，螺旋藻培养液A₅₆₀由1.706显著下降至1.345 (p<0.05)，下降了21.16%。图7(b)表明在0~60 mg/L范围内，随着胞外多糖浓度的逐渐增高，螺旋藻的生长抑制效果逐渐明显，细胞干重由2.382 g/L显著降低至1.785 g/L (p<0.05)，其对螺旋藻的生长抑制率也由8.35%显著增加至25.06%。通过胞外多糖的反加实验与正常培养得出，螺旋藻的胞外多糖对螺旋藻生长有明显的抑制作用，且随其浓度的增加而显著提高。

图7 胞外多糖对螺旋藻的生长及其抑制效果(a~e: 图中不同字母表示显著性差异p<0.05)Fig.7 Effects of exopolysaccharides on growth of S. platensis and its inhibitory rate (a~e: different letters showed significant difference p<0.05)

3.8　胞外多糖的FTIR及单糖分析

FTIR谱图主要用于反映物质螺旋藻胞外多糖的官能团结构及其变化。图8(a)显示在3417.24和2925.48 cm^-1附近的吸收峰分别是鼠李糖和岩藻糖中典型的O-H和C-H拉伸振动。1643.05和1745.26 cm^-1处为羰基的吸收峰；1419.35 cm^-1是C-O的拉伸振动峰，表明该物质可能含有羧基；1066.44 cm^-1处的吸收峰是醇羟基的变角振动峰；898.66 cm^-1处的吸收峰是β型糖苷键的特征吸收峰；676.89 cm^-1处是吡喃糖特征吸收峰之一，为吡喃型糖环特征峰。图8(b)为胞外多糖的单糖组成分析，结果显示胞外多糖的主要成分为岩藻糖(19.98%)、鼠李糖(15.61%)和葡萄糖(14.75%)等三种单糖，共占比50.34%，其次是半乳糖醛酸(11.12%)和半乳糖(10.78%)，最后是葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、甘露糖和核糖等。

图8 胞外多糖的红外光谱图及成分分析Fig.8 FTIR spectrum and monosaccharide analysis of exopolysaccharides

4 结论

在螺旋藻培养过程中，对水量的需求较高，目前已经开发了许多替代方案，例如使用废水、盐水以及重复使用培养基等。除了减少水资源消耗外，培养基的重复使用还可以减少基本营养素的支出，使这一过程更加经济且可持续。本试验通过研究螺旋藻在循环使用的培养基中生长情况、胞内组成成分的变化及胞外抑制物的分析鉴定，得到以下结论：

(1) 培养液重复使用后可大大降低水的消耗量及培养成本，但螺旋藻的细胞干重在循环培养过程中逐渐下降。

(2) 螺旋藻内藻蓝蛋白、叶绿素a及类胡萝卜素等营养物质含量均呈不同程度下降，胞内多糖含量均随周期次数和时间的增加而增加，但培养液经过0.45 μm滤膜、10 kDa超滤膜、S-8大孔树脂和活性炭四种方法处理后，可有效降低胞外有机物的抑制作用。

(3) 结合各处理组在循环5次利用过程中螺旋藻生长情况及胞内营养成分含量变化，其处理效果顺序为10 kDa超滤膜>S-8大孔树脂>活性炭>0.45 μm滤膜。

(4) 培养液中的胞外抑制物主要是由岩藻糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、甘露糖和核糖等单糖组成的多糖类化合物。该研究结果为螺旋藻的绿色可持续低成本高效培养利用奠定基础。

略

Efficient recycling of Spirulina platensis culture medium and identification of its growth inhibitors

Yue ZHOU ¹ Yu WANG ¹Leipeng CAO ^1,² Yuhuan LIU ¹ Ruijuan FAN ¹Zhenghua HUANG ³Zixuan WEN ¹

1. State Key Laboratory of Food Science and Resource, Engineering Research Center for Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330047, China
2. Academician Workstation, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang, Jiangxi 330004, China
3. Research Institute of Quality, Safety and Standards of Agricultural Product, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang, Jiangxi 330200, China

Abstract: Spirulina platensis (S. platensis) and its derivative products, have garnered considerable attention in the realms of food and biomedicine due to their high nutritional content. However, during the cultivation of S. platensis, copious amounts of water are required for both cell growth and nutrient suspension, leading to high water usage, increased costs, extensive nutrient waste, and substantial growth inhibition during the recycling process. This study aimed to assess the effectiveness of treating culture solution of S. platensis using four methods (0.45 μm filter membrane, 10 kDa ultrafiltration membrane, macroporous resin S-8, and activated carbon), evaluate the changes of growth and nutrient compositions of S. platensis after five recycles of culture solution, and identify the characteristics of extracellular inhibition and its constituents. The results showed that the circulation culture of Spirulina could greatly reduce the water consumption and culture cost, and improve the yield and quality of Spirulina. The culture solution pretreatment of S. platensis could effectively reduce the inhibition effect of extracellular organic matter, the negative effects can be effectively reduced, so that there was almost no difference between the microalgae obtained from the reused medium and the fresh medium and the order of treatment effects were 10 kDa ultrafiltration membrane>macroporous resin S-8>activated carbon>0.45 μm filter membrane. After five recycles of culture solution, the cell weight of S. platensis in the 10 kDa ultrafiltration membrane treatment group decreased only 5.9%, and that of the 0.45 μm filter membrane treatment group significantly decreased about 22% (p<0.05), but its intracellular polysaccharide content increased 217% due to the coercive effect of cell metabolism. In addition, the extracellular inhibitors in the culture solution were mainly extracellular polysaccharide, consisting of monosaccharides such as fucose (19.98%), rhamnose (15.61%), and glucose (14.75%). Therefore, this research holds significant implications for enabling sustainable, large-scale spirulina cultivation via the recycling of spirulina culture fluid. In addition, it contributes to nutrient accumulation, cost reduction, and decreased usage of nutrient salts.

Keywords: Spirulina platensis；recycling；ultrafiltration；phycocyanin；extracellular polysaccharides

引用本文：周悦, 王玉, 曹雷鹏, 等. 螺旋藻培养液高效循环利用及其生长抑制因子的鉴定. 过程工程学报, 2024, 24(4): 489-500. (Zhou Y, Wang Y, Cao L P, et al. Efficient recycling of Spirulina platensis culture medium and identification of its growth inhibitors (in Chinese). Chin. J. Process Eng., 2024, 24(4): 489-500, DOI: 10.12034/j.issn.1009‑606X.223192.)

作者简介：周悦，硕士研究生，食品工程专业，E-mail: 3143504068@qq.com；

作者简介：曹雷鹏，助理研究员，研究方向为螺旋藻培养及功能性食品开发，E-mail: caoleipeng@jxutcm.edu.cn

作者简介：刘玉环，研究员，研究方向为藻类食品开发及微藻在循环生态农业中应用，E-mail: Liuyuhuan@ncu.edu.cn

基金信息：重庆市自然科学基金项目(编号：CSTB2022NSCQ-MSX1634)；南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室研究项目(编号：SKLF-ZZB-202122)；江西省2023年度研究生创新专项资金项目(编号：YC2023-S150)

中图分类号： Q949.9

文章编号：1009-606X(2024)04-0489-12

文献标识码： A

收稿日期：2023-07-10

修回日期：2023-09-01

出版日期：2024-04-28

网刊发布日期：2024-05-08

http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI0MzM2MjgyOQ==&mid=2247530143&idx=2&sn=a805ea6980fa1d61c7be8681a197f795

过程工程学报

《过程工程学报》(月刊)创刊于1976年，由中国科学院过程工程研究所主办、科学出版社出版。《过程工程学报》以过程工程科学为学科基础，重点刊登材料、化工、生物、能源、冶金、石油、食品、医药、资源及环境保护等领域中涉及过程工程的原创论文。

周悦, 王玉, 曹雷鹏, 等丨旋藻培养液高效循环利用及其生长抑制因子的鉴定

1 前 言

2 实 验

2.1 材料与试剂

2.2 实验设备

2.3 实验方法

3 结果与讨论

3.1 螺旋藻产率及干重的变化

3.2 荧光活性分析

3.3 螺旋藻胞内多糖含量

3.4 螺旋藻可溶性蛋白及藻蓝蛋白含量

3.5 光合色素分析

3.6 培养液中胞外多糖含量

3.7 胞外多糖的抑制效果验证

3.8 胞外多糖的FTIR及单糖分析

4 结 论