古嘉如, 王楠, 马磊, 等丨席夫碱法制备大孔聚合物肝素亲和层析介质

文摘 2024-06-07 15:27 北京

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席夫碱法制备大孔聚合物肝素亲和层析介质

古嘉如 ¹ 王楠 ¹马磊 ¹乔娟 ¹靳海波 ¹何广湘 ¹赵岚 ²黄永东 ²张荣月 ¹

1. 北京石油化工学院，材料与化工学院/燃料清洁化及高效催化减排技术北京市重点实验室，北京 102617
2. 中国科学院过程工程研究所，国家生化工程国家重点实验室，北京 100190

DOI：10.12034/j.issn.1009-606X.223167

摘要肝素亲和层析介质因其专一性好、操作条件温和等特点，广泛应用于蛋白分离纯化，本工作以大孔聚丙烯酸酯微球为基质，肝素为配基，利用席夫碱法制备了肝素亲和层析介质。配基偶联经过三步完成，首先将大孔聚丙烯酸酯微球表面环氧基团通过0.5 mol/L H₂SO₄水解为邻羟基，然后将邻羟基氧化为醛基，最后利用醛基与肝素分子的胺基反应将肝素分子固定于微球表面。以溶菌酶为模型蛋白，主要考察了肝素偶联反应的各因素对蛋白结合容量的影响规律，包括肝素浓度、缓冲液pH及浓度、反应时间等，建立了最优偶联肝素配基的方法。所得亲和介质静态结合容量可达40.3 mg/mL，比商品GP-肝素介质高约36%，经1.0 mol/L的氯化钠洗脱，其蛋白回收率达到95%。通过扫描电子显微镜表征微球表面形貌，观察到偶联肝素后的微球仍能保持其大孔结构。考察了该类亲和介质在不同操作流速(31.8~318 cm/h)下的动态结合容量，发现操作流速提高10倍后介质结合容量仅下降12%。经10次重复使用后，动态结合容量仍可保持初始容量的81%。用于混合蛋白模型中分离乳铁蛋白，结果表明具有良好的分离效果。

关键词亲和层析；肝素；大孔层析介质；偶联方法；席夫碱法

1 前言

肝素亲和层析(Heparin Affinity Chromatography, HAC)是基于目标分子和肝素之间的可逆特异性相互作用，将目标分子从样品中分离的一种纯化技术，主要通过肝素分子上带负电荷的磺酸基和羧酸基与蛋白质上带正电荷的碱性氨基簇形成离子键，实现肝素结合蛋白，分离过程如图1^[1]所示。其中肝素是具有生物特异性的亲和配体，能够与凝血酶^[2,3]、生长因子^[4]等生物分子结合，具有结构稳定、可高压灭菌、亲和力高等优点^[5]，因此HAC在蛋白质分离^[6]、血液制品分离^[7]、病毒分离^[8,9]、囊泡^[8,9]等领域发挥着重要作用。目前，国内此类介质主要依靠进口，价格昂贵且蛋白结合容量普遍较低，难以满足生产需求。因此，制备具有高容量、高强度且经济成本较低的HAC介质具有重要意义。

图1 肝素亲和层析机理^[1]Fig.1 Principle of heparin affinity chromatography^[1]

HAC介质的性能取决于其制备方法，常用的方法有溴化氰法^[10,11]、环氧活化法^[12,13]、碳二亚胺缩合法^[14,15]和席夫碱法^[16,17]等。其中溴化氰法中基质和肝素之间形成的异脲键容易断裂，固定的肝素易脱落，导致偶联肝素密度降低。环氧活化法中环氧基易发生水解和交联反应，环氧基密度难以进一步提升，偶联肝素密度受到限制。碳二亚胺缩合法偶联肝素密度较高，但是由于羧基参与反应，减少了蛋白质固定化位点，且肝素分子上的羧基发生衍生化反应，降低固定化肝素和蛋白质之间的亲和性，导致蛋白结合容量低^[18]。席夫碱法具有蛋白结合容量较高、配基稳定的优点而备受人们关注。席夫碱法制备肝素亲和层析介质是利用肝素分子末端醛基与基质表面氨基进行偶联反应^[14,17-21]，该方法确保了肝素分子基团如羧基、磺酸基的完整性和数量，具有较高的蛋白结合容量，但肝素分子上醛基数量较少，配基密度较低的问题有待解决。因此本工作提出利用肝素分子上氨基与基质表面醛基进行席夫碱反应，肝素分子中氨基数量比醛基多，既有利于提高偶联肝素数量，也有利于保持羧基、磺酸基的完整性，从而提高该类肝素亲和层析介质的结合容量。

本工作以大孔聚丙烯酸酯微球为基质，该类微球具有机械强度高和孔径尺寸大的特点，以此为基质制备的层析介质易于实现高通量分离。配基肝素采用席夫碱法偶联到大孔微球上，并对肝素偶联条件进行优化，得到的大孔肝素亲和层析介质对溶菌酶的静态结合容量为40.3 mg/mL。将自制介质用于乳铁蛋白等蛋白的分离纯化，得到了较好的分离效果，该类介质在乳铁蛋白纯化中具有一定的应用潜力。

2 实验

2.1　材料与试剂

大孔环氧活化聚丙烯酸酯微球(FastSep-epoxy，北京博尔赛谱生物科技有限公司)，GP-肝素介质(苏州博进生物技术有限公司)，肝磷脂(北京迈瑞达科技有限公司)，溶菌酶(Lys)、乳铁蛋白(Lf)、乳球蛋白(β-La)、牛血清白蛋白(BSA)均购于上海吉至生化科技有限公司，高碘酸钠(NaIO₄)、醋酸钠(NaAc)、醋酸(HAc)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)、氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)、氯化钠(NaCl)、硫酸(H₂SO₄)等化学试剂购于国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯。

2.2　实验设备与分析仪器

AKTA Purifier 10蛋白纯化仪(美国通用公司)，L5紫外-可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)，ZD-85AD气浴恒温振荡器(常州荣华仪器制造有限公司)，HS-3垂直混合仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

2.3　实验方法

2.3.1 肝素亲和层析介质的制备

肝素亲和层析介质的制备分为三步完成，具体过程如图2所示，主要包括：

图2 制备FastSep-Hep的反应示意图Fig.2 Reaction route for preparation of FastSep-Hep

(1) 水解FastSep-epoxy环氧基为邻羟基：水解反应参照文献[22]进行，将10 mL FastSep-epoxy、50 mL 0.5 mol/L H₂SO₄水溶液加入反应瓶中，50℃下140 r/min振荡反应15 h，反应完毕后用去离子水清洗残余H₂SO₄溶液，制得水解微球FastSep-OH。

(2) 氧化FastSep-OH邻羟基为醛基：氧化反应参照文献[23]进行，取10 mL FastSep-OH与50 mL含60 mg/mL NaIO₄的NaAc-HAc (0.2 mol/L, pH=4.0)溶液在反应瓶中混合均匀，50℃下140 r/min振荡反应18 h，反应完毕后用大量去离子水洗涤至中性，制得醛基活化微球FastSep-CHO。该微球醛基量为0.2092 mmol/mL，后续肝素偶联反应因素考察皆基于该微球进行。

(3) 偶联肝素反应参考文献[14,18]方法：取10 mL FastSep-CHO、50 mL含1 g肝素和0.1 g NaBH₃CN的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ (PB)缓冲液(50 mmol/mL, pH=7.5)加入反应瓶中，35℃下140 r/min振荡反应24 h。反应结束后用去离子水清洗干净，制得FastSep-Hep介质。

2.3.2 静态结合容量(SBC)测定

选用Lys作为模型蛋白^[24]，分别测定FastSep-Hep与GP-肝素对Lys的结合容量。实验以PB缓冲液(20 mmol/L, pH=7.0)为平衡缓冲液，以上述缓冲液配制1 mg/mL Lys溶液。分别取适量的FastSep-Hep与GP-肝素于砂芯漏斗中，用去离子水洗涤抽干后，用所配制的平衡缓冲液浸泡20 min，量取1 mL (沉降湿体积)介质于50 mL离心管中，向其加入50 mL Lys溶液。室温下于垂直混合仪上振荡混合吸附6 h后，离心，取上清液测定其蛋白浓度。使用紫外分光光度计在280 nm吸收波长下测定其吸收值，根据标准曲线计算上清液蛋白浓度，按式(1)计算SBC值，数据测定取三次实验平均值。

(1)

式中，C₀为初始蛋白浓度(mg/mL)，C₁为介质结合蛋白后浓度(mg/mL)，V₁为加入蛋白溶液体积(mL)，V为测定介质体积(mL)。

2.3.3 动态结合容量(DBC)测定

平衡缓冲液(20 mmol/L PB, pH=7.0)至基线平衡，Lys浓度为1 mg/mL，首先测定未连接色谱柱100%流穿时的紫外吸光度。将FastSep-Hep与GP-肝素分别装填到色谱柱(7.5 mm×26.5 mm)内，先用5柱体积(CV)去离子水清洗，以去除其中20%乙醇，然后用平衡缓冲液5 CV平衡后，Lys溶液以159 cm/h流速进样，当穿透曲线高度达到10%时停止，采用平衡缓冲液5 CV平衡，洗脱液(20 mmol/L PB, 1.0 mol/L NaCl, pH=7.0)进行洗脱，记录10%穿透体积，按式(2)计算DBC值，数据测定取三次实验平均值。

(2)

式中，C₀为Lys浓度(mg/mL)，V_10%为10%流穿体积(mL)，V为介质体积(mL)。

2.3.4 回收率测试

平衡缓冲液(20 mmol/L PB, pH=7.0)至基线平衡，定量环体积为1 mL，Lys浓度为1 mg/mL，首先测定未连接色谱柱的空载峰面积，以其数值为100%回收率。将FastSep-Hep装填到色谱柱(7.5 mm×26.5 mm)内，先用5 CV去离子水清洗以去除其中20%乙醇，然后用平衡缓冲液5 CV平衡，定量环进样1 mL Lys溶液，采用平衡缓冲液5 CV平衡，洗脱液(20 mmol/L PB, 1.0 mol/L NaCl, pH=7.0)进行洗脱，记录洗脱峰面积。按式(3)计算回收率R(%)，数据测定取三次实验平均值。

(3)

式中，A_t为洗脱峰面积，A_e为空载峰面积。

2.3.5 不同流速对动态结合容量影响的测定

用平衡缓冲液(20 mmol/L PB, pH=7.0)配制1 mg/mL Lys溶液，将FastSep-Hep装填到色谱柱(7.5 mm×26.5 mm)内，分别测定Lys溶液进样流速为31.8, 79.5, 159.0, 238.5, 318.0 cm/h时介质的动态结合容量，考察不同进样流速对介质动态结合容量的影响。

2.3.6 稳定性测试

将FastSep-Hep装填到色谱柱(7.5 mm×26.5 mm)内，在79.5 cm/h流速下，依次进行3 CV去离子水清洗、5 CV平衡缓冲液(20 mmol/L PB, pH=7.0)平衡、Lys (1.0 mg/mL)溶液进样，当穿透曲线高度达到10%时停止，再进行5 CV平衡缓冲液平衡、5 CV洗脱液(20 mmol/L PB, 1.0 mol/L NaCl, pH=7.0)洗脱，以此为1个循环，并分别按照测定动态结合容量的方法重复测定10次循环后介质动态结合容量，考察其稳定性。

2.3.7 分离模型蛋白

用平衡缓冲液(20 mmol/L PB, pH=7.0)配制3 mg/mL混合蛋白溶液，其中包含Lf, β-La和BSA各1 mg/mL。将FastSep-Hep装填到色谱柱(7.5 mm×26.5 mm)内，在79.5 cm/h流速下，采用平衡缓冲液5 CV平衡，使用定量环进样1 mL混合蛋白溶液，最后进行0~100%梯度洗脱(20 mmol/L PB, 1.0 mol/L NaCl, pH=7.0)。

3 结果与讨论

3.1　FastSep-Hep的制备

由于肝素分子的活性很大程度上依赖于功能基团的分配形式和数量，本研究的偶联方式仅是在肝素分子链上未取代氨基与微球表面的醛基共价偶联，确保了肝素分子上羧基、磺酸基的完整性和数量，因此采用此方法制备的FastSep-Hep能够达到提高蛋白结合容量的目标。本工作重点考察偶联肝素过程中肝素浓度、PB缓冲液浓度、PB缓冲液pH、偶联时间等因素对介质结合容量影响。介质表面的肝素密度对介质结合容量有显著影响，以Lys的静态结合容量作为衡量配基密度的间接参数。

3.1.1 肝素浓度对静态结合容量的影响

首先考察了肝素浓度对配基偶联密度的影响，肝素浓度对FastSep-Hep静态结合容量的影响结果如图3所示。当肝素浓度从4 mg/mL增加至20 mg/mL时，介质静态结合容量逐步由31.5 mg/mL增大至44.5 mg/mL。FastSep-CHO表面醛基与肝素分子氨基进行亲核加成反应，肝素为亲核试剂，随着肝素浓度增加，反应速度加快，偶联肝素密度增加，进而介质静态结合容量增加。进一步增加肝素浓度，介质静态结合容量无明显增加，这与文献[20,25]报道的偶联肝素密度随肝素浓度增大而增大并趋于稳定的结果相同。起始反应混合物中肝素浓度达到20 mg/mL时，介质静态结合容量达到44.5 mg/mL，偶联肝素密度基本达到饱和。

图3 肝素浓度对静态结合容量的影响Fig.3 Effect of heparin concentration on static binding capacity

3.1.2 PB缓冲液浓度对静态结合容量的影响

研究表明硼酸盐能够与醛基形成络合物，氨基化合物(如Tris缓冲液)会降低固定化效率^[26]，因此本实验选择PB缓冲液作为反应溶剂。图4为PB缓冲液浓度在0.01~1.05 mol/L范围内制备的FastSep-Hep静态结合容量变化情况。由图可知，随着PB缓冲液浓度增加，介质静态结合容量呈现先增加后减少的趋势。0.01~0.25 mol/L的PB缓冲液下，介质静态结合容量逐渐上升，说明提高离子强度，有利于FastSep-CHO表面醛基与肝素分子胺基发生席夫碱反应。但是过高浓度的PB缓冲液出现介质静态结合容量下降现象，原因可能是过高的磷酸根浓度加强了与肝素分子的胺基结合作用，从而影响其与醛基的反应效率，导致肝素结合量减少，介质静态结合容量降低。由于0.05 mol/L的PB缓冲液浓度适中，既可保持静态结合容量，又不会引入过高的磷酸根浓度，故以此作为最优条件。

图4 磷酸缓冲液浓度对静态结合容量的影响Fig.4 Effect of phosphate buffer concentration on static binding capacity

3.1.3 PB缓冲液pH对静态结合容量的影响

PB缓冲液pH对FastSep-Hep静态结合容量的影响如图5所示。由图可知，增大PB缓冲液pH，介质静态结合容量先略微降低再逐渐升高。当pH由3.5增至12.5时，介质静态结合容量由31.0 mg/mL增至49.0 mg/mL。高pH情况下醛基与氨基发生席夫碱反应，低pH情况下醛基与羟基发生缩醛反应。缩醛反应通常是在酸性催化剂条件下进行的^[27]，在缩醛反应中，为了增加羰基碳的亲电性，需要酸通过形成氧离子来促进反应。然而过量的酸也可能导致缩醛/酮水解为醛/酮。pH过低时，部分肝素因酸度过高而失活，难以与醛基结合，且部分肝素中的N-硫酸盐水解暴露出一些己糖胺氨基^[14]，因此与蛋白结合的磺酸基数量减少，导致介质结合容量低。随着pH升高，酸性降低，肝素与羟基结合良好，继续升高pH，酸性逐渐减弱，不足以为肝素和羟基缩合反应提供良好的结合环境，因此肝素结合量降低^[28]。席夫碱反应中伯胺和醛之间形成的亚胺结构不稳定，在pH<6.5的水溶液中可认为完全分解，在碱性环境中相对稳定^[29]。且低pH会增加肝素带正电荷的氨基数量，这些氨基不能与醛基发生反应，可能会降低偶联效率；高pH下，肝素上未质子化的氨基数量较多，该游离氨基可用于偶联反应，进而肝素偶联量增加，介质静态结合容量增大。继续升高pH，反应条件较为苛刻且可能影响肝素活性，因此不继续考察更高pH条件。由于肝素在pH=7.5时稳定性最好^[30]，为保证肝素配基的最大活性，故以此作为最优条件。

图5 磷酸缓冲液pH对静态结合容量的影响Fig.5 Effect of phosphate buffer pH on static binding capacity

3.1.4 反应时间对静态结合容量的影响

图6是FastSep-Hep静态结合容量随反应时间的变化曲线。从图中可以看出，24 h后结合量达到最大，主要原因在于随着反应时间延长，微球表面的醛基逐渐减少，当消耗殆尽时配基密度不再增加。穆成华等^[20]在研究胺基琼脂糖凝胶偶联肝素分子醛基反应过程中，其配基密度对反应时间变化趋势与本工作类似。本工作主要由于空间位阻作用，FastSep-CHO上的醛基难以完全参与偶联反应，这与大多数其他大分子亲和配基偶联规律类似。

图6 反应时间对静态结合容量的影响Fig.6 Effect of reaction time on static binding capacity

通过对FastSep-CHO偶联肝素过程中影响因素的考察，得到最佳反应条件为：肝素浓度20 mg/mL，PB缓冲液浓度0.05 mol/L，PB缓冲液pH=7.5，反应时间24 h。在此条件下，制得的FastSep-Hep静态结合容量为40.3 mg/mL，比GP-肝素高约36%，具体数据如表1所示。同时可以发现该介质的蛋白动态结合量(37.6 mg/mL)与静态结合容量(40.3 mg/mL)相比，未有明显下降，主要得益于所制备介质的大孔结构，有利于增加介质的蛋白可及面积，提高蛋白分子的孔道内扩散速率^[31,32]。另外，由表可知，经1.0 mol/L的NaCl洗脱后，FastSep-Hep的蛋白回收率可达到95%。

表1 FastSep-Hep与GP-肝素对比Table 1 Comparison of FastSep-Hep and GP-heparin

3.2　FastSep-Hep表面形貌

层析介质的通透性对分离效率具有重要影响。图7为偶联肝素前后微球的扫描电子显微镜图。从图中可以看出，FastSep-Hep表面的通孔尺寸接近微米级，偶联配基后对微球表面的孔径无明显影响。此类基质微球作为层析基质，在偶联其他大分子配基时，如聚乙烯亚胺分子(分子量高达50000)^[33]，其微球表面的大孔结构仍能保留。并且还可发现该类大孔结构微球为基质的介质，其蛋白动态结合量对操作流速基本无依赖性，表明其具有较好的传质特性。本研究中肝素分子的分子量相对较小，故偶联至微球表面后，对大孔结构基本无影响，这有利于提高该亲和介质的传质效率，进而提高纯化效率。

图7 偶联肝素前(A1, A2, A3)后(B1, B2, B3)的微球形貌图Fig.7 Morphologies of microspheres before (A1, A2, A3) and after (B1, B2, B3) coupling heparin

3.3　不同流速对FastSep-Hep动态结合容量的影响

为了进一步验证大孔聚合物层析介质的传质性能，考察了FastSep-Hep在不同操作流速下的蛋白动态结合容量(DBC)^[34]，并与商品类似介质(GP-肝素)进行对比，具体结果如图8所示。由图可知，随着操作流速升高，FastSep-Hep的动态结合容量稍有下降，如318 cm/h的流速下的容量(33.7 mg/mL)相比于低流速31.8 cm/h的容量(38.4 mg/mL)下降了12%，即流速升高10倍的情况下，容量仅下降12%。随着操作流速增大，蛋白与介质接触时间缩短，蛋白分子来不及扩散进入孔内，导致蛋白动态结合容量降低^[35]。在相同测试条件下，商品GP-肝素容量下降幅度亦为12%，表明二者传质性能相当，同时也显示FastSep-Hep在高流速下能对蛋白进行有效捕获，对蛋白类大分子传质性能较好，有利于节省纯化时间，提高纯化效率。

图8 不同流速下FastSep-Hep和GP-肝素对Lys的动态结合容量Fig.8 Dynamic binding capacity of Lys in FastSep-Hep and GP-heparin at different flow rates

3.4　FastSep-Hep循环使用稳定性

亲和配基的稳定性也是亲和层析介质的重要参数，本工作考察了在79.5 cm/h操作流速下，FastSep-Hep在上样-洗脱10次循环洗脱动态吸附曲线，结果如图9所示。图中为10%穿透点的色谱曲线，可以发现随着循环次数增加，FastSep-Hep的动态结合容量有所下降。经过10次循环后介质动态结合容量约为初始容量的81%，容量仅下降19%，表明亲和配基肝素在使用过程中能保持较好的活性和稳定性。

图9 FastSep-Hep循环10次的动态吸附曲线Fig.9 Dynamic adsorption curves of FastSep-Hep after 10 cycles

3.5　FastSep-Hep分离模型蛋白

为进一步评价FastSep-Hep介质的亲和特异性，分别考察了BSA, β-La, Lf及三种混合蛋白的色谱行为，如图10所示。可以看出，BSA和β-La在FastSep-Hep亲和层析柱上均不保留，与亲和介质未发生特异性相互作用，且FastSep-epoxy亲水性也有利于减少非特异性吸附^[17]。Lf出现单一洗脱峰，表明其全部被FastSep-Hep吸附，这是因为Lf三维结构中的N-末端有一个可以与糖胺聚糖结合的正电荷表面，因此肝素对Lf具有较高的选择性^[36]。混合蛋白的色谱保留行为与Lf蛋白保持一致。图11是FastSep-Hep分离纯化模型蛋白SDS-PAGE凝胶电泳分析，流穿峰中未发现Lf条带，同时洗脱峰中除Lf外，无其他蛋白条带。综上研究表明，肝素亲和层析介质对Lf有特异性结合作用，在Lf纯化中具有较好的应用前景。

图10 FastSep-Hep对乳铁蛋白的亲和层析图谱Fig.10 Affinity chromatography of FastSep Hep for lactoferrin

图11 FastSep-Hep分离模型蛋白的SDS-PAGE电泳分析结果(1. marker，2. BSA标准品，3. Lf标准品，4. β-La标准品，5. 混合蛋白，6. 流穿峰，7. 洗脱峰)Fig.11 SDS-PAGE analysis for model proteins purification using FastSep-Hep (1. molecular weight marker, 2. bovine serum albumin (BSA), 3. lactoferrin (Lf), 4. β-lactoglobulin (β-La), 5. mixed proteins, 6. flow-through, 7. elution)

4 结论

本工作以大孔聚丙烯酸酯微球为基质，采用席夫碱法制备了肝素亲和层析介质，优化了制备工艺，建立了基于大孔聚合物微球的肝素亲和层析介质的制备方法，探索了制备条件与介质吸附性能之间的规律关系，并对该类介质的色谱性能进行了评估，得到以下结论：

(1) 以大孔聚丙烯酸酯微球为基质，将肝素通过席夫碱法以共价键形式偶联到微球上，其最佳偶联条件：肝素加入量20 mg/mL，PB缓冲液浓度0.05 mol/L，PB缓冲液pH=7.5，反应时间24 h。基于该偶联反应得到了以肝素为配基的亲和层析介质，该介质对溶菌酶静态结合容量为40.3 mg/mL，比商品GP-肝素介质高约36%。

(2) 通过扫描电子显微镜观察发现，大孔聚丙烯酸酯微球偶联肝素后仍保留大孔结构。在318 cm/h操作流速下，介质动态结合容量与31.8 cm/h相比仅下降12%左右，与商品GP-肝素传质性能相当，表明该类介质适合生物大分子的快速传质。

(3) 大孔聚丙烯酸酯微球重复使用性能好，10次循环后介质动态结合容量仍能保持初始容量的81%，表现了较好的稳定性。介质从混合蛋白模型中分离出乳铁蛋白，展示了该介质对乳铁蛋白有较好的特异性吸附能力。

略

Preparation of macroporous polymer heparin affinity chromatography medium by Schiff base method

Jiaru GU ¹ Nan WANG ¹Lei MA ¹Juan QIAO ¹Haibo JIN ¹Guangxiang HE ¹Lan ZHAO ²Yongdong HUANG ²Rongyue ZHANG ¹

1. College of New Materials and Chemical Engineering, Beijing Institute of Petrochemical Technology, Beijing Key Laboratory of Fuel Cleanliness and Efficient Catalytic Emission Reduction Technology, Beijing 102617, China
2. State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China

Abstract: The heparin affinity chromatography is widely applied for purification of proteins due to its high specificity and ease of operation. The heparin affinity chromatography medium was prepared through Schiff base method using heparin as the ligand, which was based on the macroporous polyacrylate microspheres. Firstly, the epoxy groups in the macroporous microspheres were hydrolyzed to be o-hydroxy through 0.5 mol/L H₂SO₄ aqueous solution. Secondly, the o-hydroxy was further oxidized to be aldehyde groups. Finally, the heparin was immobilized in the macroporous microsphere through the reaction between aldehyde groups and amino groups. The effects of operating conditions on the coupling reaction were investigated and optimized including the concentration of heparin, pH, buffer concentration, and reaction time. The effect of the reaction factor on the adsorption of proteins was evaluated using lysozyme as model protein. The optimal reaction conditions were found and the static binding capacity of the model proteins reached 40.3 mg/mL. This value was about 36% higher than that of the commercial GP-heparin. The protein recovery in this medium reached 95% with 1.0 mol/L NaCl as elution solvent. The morphology of the microspheres was observed by scanning electron microscopy. The result showed that the throughput pores were maintained in the affinity medium. The dynamic binding capacity of lysozyme on the affinity support was determined under different flow rates (31.8~318 cm/h). The result indicated the capacity at 318 cm/h decreased by about 12% in comparison with that at 31.8 cm/h. The dynamic binding capacity remained 81% of the initial value after 10 cycles. The synthesized affinity medium was used to isolate lactoferrin from mixtures. The results showed that it had a high separation efficiency.

Keywords: affinity chromatography；heparin；macroporous chromatography medium；coupling method；Schiff base method

引用本文：古嘉如, 王楠, 马磊, 等. 席夫碱法制备大孔聚合物肝素亲和层析介质. 过程工程学报, 2024, 24(4): 480-488. (Gu J R, Wang N, Ma L, et al. Preparation of macroporous polymer heparin affinity chromatography medium by Schiff base method (in Chinese). Chin. J. Process Eng., 2024, 24(4): 480-488, DOI: 10.12034/j.issn.1009‑606X.223167.)

作者简介：古嘉如，硕士研究生，材料与化工专业，E-mail: 1529652560@qq.com；

作者简介：张荣月，教授，研究方向为层析介质开发与应用，E-mail: ryzhang@iccas.ac.cn

基金信息：国家自然科学基金面上项目(编号：22074148)；国家重点研发计划课题(编号：2021YFC2103401)

中图分类号： O658.1；TQ937

文章编号：1009-606X(2024)04-0480-09

文献标识码： A

收稿日期：2023-06-11

修回日期：2023-10-29

出版日期：2024-04-28

网刊发布日期：2024-05-08

http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI0MzM2MjgyOQ==&mid=2247530143&idx=1&sn=e36e3e527a939e3bab59239acd28644f

过程工程学报

《过程工程学报》(月刊)创刊于1976年，由中国科学院过程工程研究所主办、科学出版社出版。《过程工程学报》以过程工程科学为学科基础，重点刊登材料、化工、生物、能源、冶金、石油、食品、医药、资源及环境保护等领域中涉及过程工程的原创论文。

古嘉如, 王楠, 马磊, 等丨席夫碱法制备大孔聚合物肝素亲和层析介质

1 前 言

2 实 验

2.1 材料与试剂

2.2 实验设备与分析仪器

2.3 实验方法

3 结果与讨论

3.1 FastSep-Hep的制备

3.2 FastSep-Hep表面形貌

3.3 不同流速对FastSep-Hep动态结合容量的影响

3.4 FastSep-Hep循环使用稳定性

3.5 FastSep-Hep分离模型蛋白

4 结 论