陶思然 程俊 曹磊 周燕 ![]()
谭文松
华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237
DOI：10.12034/j.issn.1009-606X.223245
摘 要 慢病毒载体能将外源基因稳定整合至多种细胞的基因组，在基因治疗领域中具有广泛应用。固定床反应器可规模化培养贴壁细胞并通过质粒瞬时转染的方式生产慢病毒，但其慢病毒产量受到各种操作参数的影响。本研究对慢病毒生产过程中质粒转染条件和细胞培养参数进行优化，并在国产固定床反应器中验证了优化后的工艺。结果表明，在质粒转染过程中，当PEI与DNA混合时质量比在2:1及以上、转染时的DNA浓度等于或高于2 μg/mL、转染6 h及以上时可显著提高质粒转染效率；而混合时的DNA浓度和混合时间对转染效率的影响较小，其主要影响外源基因在细胞中的表达。在HEK293T细胞培养中，在5.0×104 cells/cm2的高接种密度下细胞在固定床载体表面均匀分布并较快进入指数生长期；而转染时过高或过低的细胞密度均不利于慢病毒生产，当细胞密度为1.0×106 cells/cm2时，可获得较高的慢病毒滴度。采用上述优化的工艺条件，在表面积为2.0 m2的国产固定床反应器中收获的慢病毒产量达2.4×1010 TU。本研究结果为建立基于固定床反应器的慢病毒载体高效生产工艺提供数据支撑。关键词 固定床生物反应器；慢病毒；转染条件；细胞培养参数基因治疗是将外源遗传物质转移到患者细胞中，通过抑制或增强基因表达、修正靶基因，从而实现疾病治愈的一种治疗手段[1]。自2015年起，基因治疗迅速发展[2]，仅2018至2020年就已完成了18项基因治疗的临床试验[3-5]。成功进行基因治疗的前提是外源遗传物质能够安全、高效地进入细胞。在诸多外源基因的转移方法中，慢病毒载体具有巨大的应用潜力。慢病毒属于逆转录病毒科中的复杂逆转录病毒，大多由人类免疫缺陷病毒-1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1, HIV-1)改造而来[6,7]，其具有将外源基因稳定整合至宿主细胞基因组的能力，且可转导非分裂细胞[8,9]。在英国，慢病毒载体存在于57%的先进治疗药物(Advanced Therapy Medicinal Product, ATMP)中。美国、中国、欧盟和加拿大正在进行的100多项临床试验中使用慢病毒载体进行体外细胞修饰或体内治疗[10]。由于慢病毒在临床试验中颇受青睐以及CAR-T疗法Kymriah和Yescarta的市场批准，预计到2026年慢病毒市场将增长至8亿美元[11]。慢病毒的生产方法主要使用贴壁生长的HEK293T细胞，以多质粒瞬时转染的方式使编码慢病毒组分的质粒在细胞中表达[12,13]，慢病毒组装后通过分泌进入培养上清液中。为实现慢病毒的生产，需要对HEK293T细胞进行规模化贴壁培养。近年来，在用于细胞大规模贴壁培养的设备中，固定床反应器日渐受到关注[14,15]。固定床反应器也称为填充床反应器，其主体为一个圆柱形容器，其中填充的多孔载体构成固定床。培养时，细胞在多孔载体上截留、贴附和扩增。培养基通过载体床层灌注，为载体上生长的细胞提供营养，同时去除代谢副产物[11,16]。固定床反应器具有贴附面积大、剪切力小、可精确控制培养环境等优点，适于贴壁细胞培养和病毒生产[17-19]。一些商业化的固定床反应器，如Pall公司的iCELLis一次性反应器和Univercells公司的Scale-X一次性反应器已实现慢病毒的生产[20,21]。该两类反应器的固定床均含有一个塑料制成的内筒，以聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene Terephthalate, PET)无纺布作为固定床层的填料。其中，iCELLis反应器以碎片式的PET无纺布散乱堆积构成固定床层，Scale-X反应器则由PET无纺布卷成筒状构成固定床层。培养基通过磁子或叶轮搅拌后自下而上流经固定床层，随后在床层上部溢出，沿内筒外壁流下并进行气体交换。在以固定床反应器生产慢病毒的过程中，转染条件(如转染时DNA的浓度、转染试剂与DNA的比例)以及细胞培养操作参数(如接种密度、转染时的细胞密度等)均影响慢病毒的生产[11]。然而，不同文献中固定床反应器的最适生产条件不同[22,23]。为了实现高效的慢病毒生产，需要探究转染条件对转染效率的影响和操作参数对慢病毒滴度的影响，据此设计并开发慢病毒生产工艺。本研究首先考察了转染试剂聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine, PEI)与DNA的混合比例、混合时的DNA浓度和混合时间、转染时的DNA浓度和转染时间对转染效率及外源基因表达的影响；随后基于摇瓶的动态培养研究细胞接种密度和转染时的细胞密度对细胞在PET无纺布上的生长和慢病毒生产的影响；最后在国产固定床反应器中应用优化后的转染条件和细胞培养参数进行慢病毒生产。研究结果为进一步优化和建立基于固定床反应器的慢病毒生产工艺提供基础数据。HEK293T细胞(由浙江理工大学提供)，高糖DMEM培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，Gibco公司，粉末)，碳酸氢钠、氯化钾、磷酸二氢钠、氯化钠、乙二胺四乙酸(均为Sigma公司，>99%)，胎牛血清(Biosun公司，优级)，青霉素(碧云天生物技术有限公司，1600 U/mg)，链霉素(碧云天生物技术有限公司，≥720 U/mg)，胰蛋白酶(Gibco公司，1:250)，结晶紫(Sigma公司，>90%)，Triton X-100 (国药化学试剂有限公司，>98%)，细胞活死染色试剂盒(翌圣生物科技股份有限公司)，葡萄糖检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，聚乙烯亚胺(PEI，上海懋康生物科技有限公司，25 kDa)，慢病毒包装质粒psPAX2 (Addgene公司，#12260)，慢病毒包膜质粒pMD2.G (Addgene公司，#12259)，慢病毒转移质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro (System Biosciences公司，CD511B-1)，聚凝胺(碧云天生物技术有限公司，>94%)，丁酸钠(Aladdin公司，>99%)，PET无纺布(上海同腾生物科技有限公司)。二氧化碳培养箱、摇床(Thermo Scientific公司)，细胞计数仪(Counter Star公司)，Allegra X-15R离心机(Beckman Coulter公司)，HVA-85灭菌锅(Hirayama公司)，Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)，摇瓶(Corning公司)，FE200 pH计(Mettler Toledo公司)，流式细胞仪(Beckman Coulter公司)，倒置荧光显微镜、普通显微镜(Olympus公司)，BT-2固定床生物反应器(上海同腾生物科技有限公司)。HEK293T细胞在37℃、5% CO2的培养箱中以含10% (v/v)胎牛血清的高糖DMEM培养基进行培养。当HEK293T细胞密度培养至2.0×105 cells/cm2时进行质粒转染。将一定量含绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)标记基因的慢病毒转移质粒与转染试剂PEI充分混合，静置数分钟，以无血清DMEM培养基稀释混合溶液。从6孔板中吸出细胞培养上清液，加入1 mL混合溶液，于37℃下转染。转染后将混合溶液吸出，加入含血清培养基。37℃下培养24 h后，消化细胞并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，随后使用流式细胞仪分析绿色荧光细胞占比和相对荧光强度。其中绿色荧光细胞占比用于表征转染效率，相对荧光强度用于表征基因表达量。当孔板和PET无纺布上的细胞密度达到2.0×105 cells/cm2后，按1 μg/106 cells的质粒DNA含量计算所需的DNA质量。将转移质粒、包膜质粒和包装质粒按2:1:1的质量比混合并转染。转染后，将孔板中的混合溶液替换为2 mL含血清培养基，于37℃下继续培养10 h。随后向孔中加入12 μL浓度为500 μmol/mL的丁酸钠溶液，使孔板中的丁酸钠浓度为3 μmol/mL。转染72 h后，取培养上清并进行病毒滴度检测。向125 mL摇瓶中加入100片0.5 cm×0.5 cm的PET无纺布。本实验所用的PET无纺布纤维直径为40~50 μm，孔隙率约为82.2%，水接触角为106.6°。灭菌冷却后，加入15 mL含血清培养基，于37℃下浸泡。浸泡过夜后，将HEK293T细胞按不同的密度接种至摇瓶中，补充培养基至20 mL，并于37℃、130 r/min摇床上培养。接种后，每两天换液，并取PET无纺布样品进行细胞核计数和细胞活死染色，共培养14天。细胞转染过程中使用的培养液体积均为20 mL。接种后，每天取样并进行细胞核计数。当细胞密度达到一定值后，按2.3.2节中的条件生产慢病毒。将细胞培养后的PET无纺布样品在EP管中剪碎，加入200 μL含0.1wt%结晶紫和0.1wt% Triton X-100的低渗结晶紫溶液，于摇床上震荡4 h。而后用移液枪充分吹打，以血球计数板计数细胞核，并计算细胞数。将细胞培养后的PET材料样品转移至新的24孔板中，经PBS漂洗后，用细胞活死染色试剂盒进行染色。37℃孵育30 min后吸去溶液，经PBS漂洗后使用荧光显微镜拍照。48孔板中接种一定密度的HEK293T细胞，使其在测定病毒滴度当天的细胞密度接近1.0×105 cells/cm2。获得含病毒颗粒的悬液后，以含8 μg/mL聚凝胺的培养基按5倍的梯度稀释病毒液。吸出48孔板中培养上清液，每孔分别加入200 μL稀释后的病毒液，于37℃下培养过夜。第二天向孔中补充800 μL含血清培养基，继续培养48 h后，消化细胞，并用PBS洗涤细胞，使用流式细胞仪分析绿色荧光细胞占比。慢病毒滴度按式(1)计算[24]。式中，T为病毒原液的滴度(TU/mL)，P为表达绿色荧光蛋白的细胞的百分比(%)，D为病毒液的稀释倍数，X为使用病毒液感染细胞时细胞的数量(cells)，0.2为每孔加入病毒液的体积(mL)。在测定病毒滴度时，为避免多个病毒颗粒感染同一个细胞而对结果产生干扰，选用绿色荧光细胞占比为2%~30%的稀释倍数进行计算。图1为用于慢病毒生产的固定床反应器系统示意图，其中固定床层外部为一个直径57 mm，高度100 mm的不锈钢圆筒，圆筒内部安置卷筒状结构的固定床层，由两条PET无纺布及一条聚丙烯网格(规格均为125 cm×10 cm)按PET-PET-聚丙烯的排列方式缠绕而成，等效面积约为2 m2。两层PET无纺布之间插有数条0.5 cm×12 cm的PET无纺布取样条。固定床层底部设有整流板，以确保经磁子搅拌后输送的培养基为均匀流动的液体。培养基流经固定床层后，沿圆筒外壁流下，完成气体交换。![]()
图1 固定床反应器系统示意图
Fig.1 Schematic diagram of fixed-bed bioreactor system细胞接种前一天，对反应器及管路系统进行灭菌，冷却后向反应器内泵入600 mL培养基，开启加热夹套和磁力搅拌器，设置温度为37℃，搅拌转速为680 r/min，进气量为60 mL/min，溶氧为50%，pH为7.0，维持上述参数过夜，以平衡反应体系。平衡过夜后，将反应器表面充分消毒，而后转移至超净台中，打开反应器取样盖，快速将HEK293T细胞悬液加入反应器，拧紧取样盖，并补充培养基至700 mL。以680 r/min的转速培养6 h，将转速降至580 r/min，并开启与储液瓶间的循环。培养过程中，每天从反应器中取出取样条和培养上清液，计数细胞核，测定葡萄糖浓度。当葡萄糖浓度低于5 mmol/L时，更换培养基。当细胞密度达到转染要求时，将反应器中的培养上清液泵出，泵入700 mL含PEI-DNA复合物的无血清DMEM培养基，转速调为680 r/min并培养6 h。转染结束后，更换为等体积的含血清培养基，转速调为580 r/min，培养10 h，随后开启与储液瓶间的循环，储液瓶中为含有3 μmol/mL丁酸钠和血清的培养基。慢病毒生产期间，每天取培养上清液，测定葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度低于5 mmol/L时，更换培养基。更换培养基前及转染72 h后，取培养上清液，检测其中的慢病毒滴度。本实验数据通过Graphpad Prism 8进行统计分析。采用“t检验”分析两组间的统计学差异，每组设置三个平行。经统计学处理，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。本实验使用的PEI分子量为25 kDa，其具有高转染效率和低细胞毒性，是普遍认同的转染“金标准”[25]。实验转染条件分别设置为：转染试剂PEI与DNA的质量比为0.5:1, 1:1, 2:1, 4:1, 6:1，PEI与DNA混合时的DNA浓度为5, 10, 20, 40, 60 μg/mL，混合时间为0, 5, 10, 20, 30, 60 min，转染时的DNA浓度为1, 2, 3, 4 μg/mL，转染持续时间为2, 4, 6, 8, 10, 12 h。如图2所示，当PEI与DNA质量比为2:1，转染时DNA浓度为2 μg/mL，转染时间为6 h时，转染效率即可达到最高，继续增加此3个转染条件的设置值，转染效率不再提高[图2(a), 2(d), 2(e)]。而混合时的DNA浓度和混合时间对转染效率无显著影响[图2(b), 2(c)]。![]()
图2 转染条件对转染效率的影响：(a) PEI:DNA；(b) 混合时DNA浓度；(c) 混合时间；(d) 转染时DNA浓度；(e) 转染时间 (**: p<0.01; ***: p<0.001)
Fig.2 Effects of transfection conditions on transfection efficiency: (a) PEI:DNA; (b) DNA concentration during mixing; (c) mixing time; (d) DNA concentration during transfection; (e) transfection time (**: p<0.01; ***: p<0.001)
由图3可知，PEI与DNA的质量比、转染时的DNA浓度和转染时间对外源基因表达影响较大。PEI与DNA的比例为0.5:1时，因极少细胞被转染，基因表达量接近0；当两者比例为2:1时相对荧光强度最大，随比例继续增大，相对荧光强度小幅下降[图3(a)]。转染时DNA浓度增大、转染时间延长均有利于外源基因表达[图3(d), 3(e)]，但较高的DNA浓度将增加生产成本，且在无血清培养条件下长时间转染可能导致细胞活性降低。因此，选择2 μg/mL的DNA浓度和6 h的转染时间。混合时DNA浓度和混合时间对基因表达量的影响较小，二者分别为20 μg/mL和10 min时基因表达量最高[图3(b), 3(c)]。![]()
图3 转染条件对基因表达的影响：(a) PEI:DNA；(b) 混合时DNA浓度；(c) 混合时间；(d) 转染时DNA浓度；(e) 转染时间 (*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001)
Fig.3 Effects of transfection conditions on gene expression: (a) PEI:DNA; (b) DNA concentration during mixing; (c) mixing time; (d) DNA concentration during transfection; (e) transfection time (*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001)
在各转染条件中，PEI与DNA的质量比对转染效率和基因表达的影响最大。当PEI与DNA的质量比过小时，PEI可能无法完全与DNA聚合，影响聚集体颗粒与细胞表面接触并内吞进入细胞，导致转染失败[26]。此外，转染时DNA浓度和转染时间对转染效率和基因表达的影响也较大。增大DNA浓度能提高外源基因表达，这可能是因为随着DNA浓度增加，形成的聚集体颗粒增多，与细胞的接触概率增大，摄入细胞的颗粒数量增加，进而促进外源基因表达[27]；同时，较长的转染时间也有利于转染效率和基因表达的提高。考虑到转染时使用含血清培养基降低转染效率[28]，而长时间处于无血清环境中可能影响细胞活性，因此需控制合适的转染时间参数。基于优化后的转染条件，在孔板和载有PET无纺布的孔板中进行慢病毒生产。如图4所示，在孔板中进行细胞培养时，生产的慢病毒滴度较高，可达2.9×107 TU/mL [图4(a)]，表明在优化的转染条件下可以生产高滴度的慢病毒。与孔板组相比，PET无纺布组的慢病毒滴度较低。考虑到PET无纺布具有较高的比表面积，与孔板相比可以支持更多的细胞贴附和生长，因此需优化转染时的细胞密度等参数，以提高收获的慢病毒滴度。![]()
图4 孔板及PET无纺布生产的慢病毒滴度：(a) TU/mL；(b) TU/cm2；(c) TU/cell (***: p<0.001)
Fig.4 Titers of lentivirus produced in well plates and PET nonwoven fabric: (a) TU/mL; (b) TU/cm2; (c) TU/cell (***: p<0.001)
将PET无纺布片置于摇瓶中，采用动态培养模型模拟固定床反应器中的培养过程，探究接种密度对细胞生长的影响。将HEK293T细胞按2.0×103, 5.0×103, 1.0×104, 5.0×104 cells/cm2的密度分别接种至摇瓶中并进行培养。由图5可知，在1.0×104和5.0×104 cells/cm2的接种密度下，摇瓶中HEK293T细胞生长良好。在5.0×104 cells/cm2的接种密度下，细胞在第6天进入指数生长期，第12天时细胞密度最高，达到2.8×106 cells/cm2。此后细胞生长进入稳定期。1.0×104 cells/cm2接种密度下的细胞生长稍显滞后，在第8天进入指数生长期，第14天细胞密度最高。该两种接种密度下培养至第12天和第14天时，细胞密度无统计学差异。与之相比，2.0×103和5.0×103 cells/cm2的接种密度下细胞生长缓慢，二者在培养第14天的细胞密度仅为2.3×105和9.9×105 cells/cm2。与孔板等二维平面培养相比，摇瓶中培养于PET无纺布中的细胞较晚进入指数生长期，这可能是因为在转瓶动态培养中培养液流动和PET无纺布运动产生的剪切力影响细胞的贴附、生长和活性[29]。![]()
图5 不同接种密度下的HEK293T细胞生长曲线Fig.5 Growth curves of HEK293T cells under different inoculation densities图6为不同接种密度下第6, 10和14天的细胞活死染色结果，活细胞被染成绿色，死细胞被染成红色。在较高的接种密度(1.0×104和5.0×104 cells/cm2)下，HEK293T细胞在PET无纺布上的分布较为均匀。培养至第10天时，5.0×104 cells/cm2组的细胞已长满整个无纺布，活性良好。而接种密度降低，PET无纺布上的细胞呈团簇聚集，不均匀的细胞分布和过低的细胞密度不利于质粒转染和病毒生产。因此，后续实验将采用5.0×104 cells/cm2的接种密度。![]()
图6 不同接种密度下的HEK293T细胞活性和分布Fig.6 Viabilities and distributions of HEK293T cells under different inoculation densities根据活死染色的结果，在5.0×104 cells/cm2的接种密度下，细胞铺满材料表面时的细胞密度约为1.0×106 cells/cm2。进一步提高细胞密度，细胞聚集生长，不利于其摄取PEI-DNA复合物颗粒，同时营养物和代谢副产物等物质传递受阻，影响慢病毒生产能力，因此需考察转染时细胞密度对慢病毒生产的影响。3.5 动态培养下转染时的细胞密度对慢病毒滴度的影响
设置转染时的细胞密度分别为2.0×105, 5.0×105, 1.0×106, 2.0×106 cells/cm2，考察其对慢病毒生产的影响。由图7可知，转染时细胞密度为2.0×105和5.0×105 cells/cm2时，单细胞产毒量相近，约为0.5 TU/cell。当细胞密度升至1.0×106 cells/cm2时，单细胞产毒量提高至0.8 TU/cell；与其他各组相比，单位体积、单位载体面积、单位细胞的病毒产量均最高。当细胞密度进一步升至2.0×106 cells/cm2时，单细胞产毒量反而下降。推测单细胞产毒量的上升是由于转染时细胞密度增加使细胞均匀分布于三维支架表面，有利于细胞摄取PEI-DNA复合物颗粒[30,31]。当转染时细胞密度过高时，细胞在PET纤维中发生重叠、聚团，由此可能影响细胞与PET-DNA复合物颗粒的接触和摄取，进而降低单个细胞生产的慢病毒滴度[18]。但由于细胞密度高，因此总病毒滴度仍然比低细胞密度转染时较高。基于此，后续研究采用1.0×106 cells/cm2的细胞密度进行质粒转染。![]()
图7 转染时的细胞密度对慢病毒滴度的影响：(a) TU/mL；(b) TU/cm2；(c) TU/cell (与“10”对比; ***: p<0.001)
Fig.7 Effects of cells density on the titer of lentivirus during transfection: (a) TU/mL; (b) TU/cm2; (c) TU/cell (compared with “10”; ***: p<0.001)
上述结果表明，在摇瓶中基于PET无纺布进行细胞动态培养和慢病毒生产，慢病毒滴度最高仅为7.2×105 TU/mL，低于文献中报道的在固定床反应器中生产的病毒滴度(106~107 TU/mL)[32,33]。在本研究过程中发现，在病毒生产阶段，培养液中出现悬浮的细胞聚团，推测转染时无血清培养条件以及过高的摇瓶转速所致的流体剪切力导致细胞从PET无纺布上脱落，从而使最终收获的慢病毒滴度较低[29,34]。在固定床反应器中以5.0×104 cells/cm2的密度接种细胞，培养期间每天取样，检测细胞生长；当细胞密度达到1.0×106 cells/cm2时进行转染，转染6 h后更换含血清培养基。慢病毒生产期间每天检测培养上清液中葡萄糖浓度。图8为固定床反应器中生长阶段HEK293T细胞生长曲线。培养第1天时细胞密度为5.7×104 cells/cm2，大于接种密度，表明在该固定床反应器中细胞贴附率较高，并较早地启动细胞生长。在第3天细胞生长进入指数生长期，第5天细胞密度增加至1.0×106 cells/cm2。与摇瓶的培养结果相比，固定床反应器中细胞更快进入指数生长期，表明固定床反应器对细胞的截留效率高于摇瓶培养体系，在同样的细胞接种密度下可提供较高的细胞生长起始密度，促进细胞生长。![]()
图8 固定床反应器中的细胞生长曲线Fig.8 Cell growth curve in fixed-bed bioreactor图9为固定床反应器中生长阶段的细胞活性和分布情况。由图可知，PET无纺布是由无序堆积的纤维形成的三维细胞培养载体；除部分纤维较稀疏的区域，细胞经过5天生长后可较均匀地铺满材料，细胞活性良好，未见可观察到的死细胞。表明通过摇瓶培养体系所选出的接种密度和转染时的细胞密度较为合适，在充分利用无纺布固定床面积的同时未导致细胞过度重叠、聚团。![]()
图9 固定床反应器中的细胞分布Fig.9 Cell distributions in fixed-bed bioreactor如图10所示，质粒转染后第2天，即细胞接种后培养第7天，检测到培养上清液中葡萄糖浓度为9.6 mmol/L。为防止后续病毒生产时葡萄糖耗尽，在第7天更换储液瓶，并取样，测定慢病毒滴度。培养第8天结束生产，取样并测定慢病毒滴度。![]()
图10 慢病毒生产期间的葡萄糖浓度Fig.10 Glucose concentration during lentivirus production由图11可知，在质粒DNA转染后的第3天(即培养第8天)，慢病毒滴度显著增加，此时上清液中的病毒滴度可达1.3×107 TU/mL、8.5×106 TU/cm2，单细胞产毒量为8.5 TU/cell；与之相比，培养第7天时，上清液中病毒滴度为2.5×106 TU/mL、1.7×106 TU/cm2，单细胞产毒量为1.7 TU/cell。本研究在培养第7天收获1 L培养上清液，培养第8天收获1.7 L培养上清液，合计收获总病毒量为2.4×1010 TU，平均病毒滴度为8.9×106 TU/mL、9.6×106 TU/cm2 (以2 m2等效面积计算为1.2×106 TU/cm2)和9.6 TU/cell。与商业化固定床反应器的生产结果(表1)相比，本研究通过固定床反应器生产出的慢病毒滴度较高，表明所优化的转染条件和生产条件支持固定床反应器中慢病毒的高效生产。![]()
图11 固定床反应器中生产的慢病毒滴度：(a) TU/mL；(b) TU/cm2；(c) TU/cell
Fig.11 Titers of lentivirus produced in fixed-bed bioreactor: (a) TU/mL; (b) TU/cm2; (c) TU/cell
表1 固定床反应器的慢病毒生产能力Table 1 Lentivirus production capacity in fixed-bed bioreactor
固定床生物反应器作为动物细胞大规模贴壁培养的设备，在慢病毒生产领域具有巨大的潜力。本研究通过优化质粒转染条件和细胞培养参数，实现了固定床反应器中的高滴度慢病毒生产，得出以下结论：(1) PEI与DNA的质量比、转染时DNA浓度和转染时间对质粒转染影响较大，混合时DNA浓度和混合时间对质粒转染影响较小。最适转染条件为：PEI与DNA以2:1的质量比，按20 μg/mL的混合时DNA浓度混合10 min，随后稀释至DNA浓度为2 μg/mL，转染6 h后换液。(2) 在动态培养下，较低的接种密度不利于HEK293T细胞在PET无纺布上均匀分布，延迟了进入指数生长期的时间；当接种密度为5.0×104 cells/cm2时，可实现细胞快速生长。(3) 质粒转染时过高或过低的细胞密度均不利于慢病毒生产，当细胞密度为1.0×106 cells/cm2时，可收获的慢病毒滴度较高。(4) 基于优化的质粒转染条件和细胞培养参数，采用表面积为2.0 m2的国产固定床反应器培养HEK293T细胞并生产慢病毒，最终收获总病毒量为2.4×1010 TU，与进口固定床生物反应器相比，慢病毒滴度处于较高水平。
Optimization of lentivirus production process in a fixed-bed bioreactor
Siran TAO Jun CHENG Lei CAO Yan ZHOU ![]()
Wensong TAN
State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, ChinaAbstract: The lentivirus vectors can stably integrate exogenous genes into the genomes of various cells, making it useful in gene therapy. Among various bioreactors, fixed-bed bioreactors are increasingly used to scale-up the cultivation of adherent cells for the manufacture of lentivirus through plasmid transient transfection. In the fixed-bed bioreactor the production of lentivirus vectors can be heavily affected by various operating parameters. This study aims to optimize the transfection conditions and cell culture parameters during the production of lentivirus, and then validate optimized process conditions in China's domestically-made fixed-bed reactor. The results showed that during the plasmid transfection, the transfection efficiency could be significantly improved in the optimized conditions where the mass ratio of PEI to DNA was 2:1, the DNA concentration during transfection was 2 μg/mL, and the transfection time was 6 hours, respectively. The mass ratio of PEI to DNA was the key factor to the success of transfection. When the ratio of PEI to DNA was below 2:1, the transfection efficiency noticeably reduced and exogenous gene could not be expressed in the HEK293T cells. However, DNA concentration during mixing and mixing time have little effect on transfection efficiency, which mainly affects the expression of exogenous genes in cells. When the HEK293T cells were cultured in shaking bottles based on PET nonwoven fabric, the cells were evenly distributed on the surface of the scaffold and quickly entered the exponential growth phase at a high inoculation density of 5.0×104 cells/cm2. The cell densities that are too high or too low during transfection are not conducive to lentivirus production, and a high lentivirus titer can be obtained when the cell density is 1.0×106 cells/cm2. After process optimization, the lentivirus yield reached 2.4×1010 TU in the fixed-bed bioreactor with an surface of 2.0 m2. The results of this study can provide data support for the development and establishment of the production of lentivirus vectors based on a fixed-bed bioreactor.
Keywords: fixed-bed bioreactor；lentivirus；transfection conditions；cell culture parameters
引用本文： 陶思然, 程俊, 曹磊, 等. 固定床生物反应器中慢病毒生产工艺的优化. 过程工程学报, 2024, 24(6): 734-745. (Tao S R, Cheng J, Cao L, et al. Optimization of lentivirus production process in a fixed-bed bioreactor (in Chinese). Chin. J. Process Eng., 2024, 24(6): 734-745, DOI: 10.12034/j.issn.1009‑606X.223245.)
作者简介：陶思然，硕士研究生，生物化工专业，E-mail: tsr1998@163.com
作者简介：周燕，教授，主要研究方向：动物细胞体外培养过程优化，E-mail: zhouyan@ecust.edu.cn
中图分类号： Q819
文章编号：1009-606X(2024)06-0734-12
文献标识码： A
收稿日期：2023-09-10
修回日期：2023-12-28
出版日期：2024-06-28
网刊发布日期：2024-06-26
