生物催化的醛肟脱水反应是一种实用的合成腈类化合物的方法，与传统的腈类合成方法（如氨氧化和氰化反应）相比，该方法无需使用剧毒氰化物或贵金属催化剂，在常温条件下即可进行。然而，天然的醛肟脱水酶对某些化学结构不同的非天然底物催化活性较弱，尤其是对于制药相关的手性α-氨基腈类的醛肟底物几乎没有转化率。此外，反应性较低的O-烷基醛肟无法作为底物。为克服这些天然酶的限制，并扩展生物催化合成腈类的应用范围，研究者们开发了一种基于肌红蛋白的人工金属酶rMb(FePc)，该酶具有独特的电子状态和较低的氧化还原电位，能够促进醛肟脱水反应（图1）。
研究人员首先测试了rMb(FePc)催化剂在丁醛肟(1a)脱水反应中的表现。结果显示，rMb(FePc)催化剂在丁醛肟的脱水反应中表现出优异的催化活性，反应在常温和中性pH下进行，8小时后产物丁腈的产率达到68%，催化剂的总转换数为3400。实验结果显示，FePc和肌红蛋白的二级配位环境共同提升了催化活性，His64残基在反应中起到了关键的酸碱催化作用（表1）。
rMb(FePc)催化剂在24小时内可以有效催化一系列肟的脱水反应，产物收率显著提高。其中，异戊腈的总转换数达到9300。rMb(FePc)对α位有大位阻的肟同样表现出良好的催化活性，甚至对天然酶不活跃的底物也能进行有效催化。然而，对苯甲醛肟及其类似物的催化活性较低，可能是由于芳香环与活性位点的卟啉配体之间存在空间位阻。此外，rMb(FePc)对N-Boc-D-α-氨基肟表现出较高的活性，成功生成药物合成中有重要意义的手性α-氨基腈（方案1）。
rMb(FePc)催化剂对天然酶无法接受的O-烷基肟表现出广泛的催化活性，能有效脱除甲醇、乙醇、烯丙醇和苄醇，生成相应的腈类化合物。在24小时内，rMb(FePc)催化3e、5e和6e的脱醇化反应的总转换数（TONs）超过450，而天然酶ReOxd几乎没有活性。这些差异突显了铁卟啉辅基在肌红蛋白框架内的催化潜力（图2）。
受天然肟脱水酶催化机制的启发，作者通过定点突变在rMb(FePc)的活性位点引入类似酶的LBHB（低势垒氢键）结构。制备了rMbV68S(FePc)、rMbV68T(FePc)和rMbF43Y(FePc)突变体，其中在His64残基附近引入了丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基。这些突变体，尤其是rMbV68S(FePc)，对肟1a的脱水反应表现出更高的催化活性。该反应通常在1小时内完成，rMbV68S(FePc)的转化频率（TOF）达到165 min−1，比未突变的rMb(FePc)高出24倍。然而，rMbV68S(FePc)在O-甲基肟3a的脱醇化反应中的催化活性较低，因为3a缺少可以与Ser68残基形成LBHB的质子化羟基，这与天然肟脱水酶的结果一致（图3）。
总之，本研究通过将人工合成的FePc辅因子重新构建至肌红蛋白中，成功实现了肟的脱水反应。rMb(FePc)催化剂对多种肟表现出高效的脱水活性，在脂肪族肟的脱水反应中，总转换次数（TON）最高达到9300。此外，人工金属酶还能将天然肟脱水酶无法催化的低反应性O-烷基肟转化为相应的腈类化合物。实验结果（包括Brønsted图分析和rMb(FePc)的定点突变）揭示了His和Ser残基在促进脱水反应中的重要作用，并据此进一步增强了rMb(FePc)的活性。这些研究结果不仅展现了该人工金属酶的多功能催化能力，还为设计用于腈类合成的生物催化剂提供了新的机制见解。
作者信息及链接：
研究方向：1. 卟啉及金属卟啉的合成、结构与反应性；2. 含非天然辅基的血红蛋白的制备；3. 四吡咯大环化合物及其金属配合物的物理化学性质；4. 血红蛋白和非血红蛋白功能的改进和转化；5. 血红蛋白分子机制的阐明；6. 血红蛋白的超分子组装；7. 生物无机化学的实际应用
文章信息：Reconstitution of Myoglobin with Iron Porphycene Generates an Artificial Aldoxime Dehydratase with Expanded Catalytic Activities
文章链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.4c03220
