含氟氨基酸在药物合成中具有重要作用，氟原子独特的理化性质与氨基酸的酸碱官能团加成，可以提高药物的药代动力学特性。然而，传统的化学合成方法常需额外的手性助剂或金属配体来控制氨基酸的立体选择性，现有的酶合成方法含氟底物成本较高，氧化还原酶类涉及到的复杂辅酶循环过程也限制了其工业生产和应用。因此，亟需开发一种高效、成本低廉且条件温和的含氟l-α-氨基酸的新合成方法。因此，天津大学罗云孜研究团队提出了一种三步的化学-酶法级联反应，用于不对称合成手性含氟氨基酸。![]()
该方法使用一系列成本较为低廉的醛类作为起始材料，通过醛缩酶催化的醇醛缩合反应实现含氟模块碳链的延长。随后，通过化学脱羧反应生成还原胺化的底物，在苯丙氨酸氨裂解酶的作用下，最终生成多种含氟芳香l-α-氨基酸产物，对映体纯度高达99%（图1）。进一步，本研究使用全细胞生物催化剂在制备规模合成了三种可被用作药物合成前体的含氟l-α-氨基酸，扩展了该方法的普适性。相关文章发表在ACS Sustainable Chemistry & Engineering，文章题目是：Chemoenzymatic Synthesis of Fluorinated L-α-Amino Acids![]()
图1. 含氟芳香氨基酸基序的应用和合成路线。
a. 含有氟代芳香氨基酸的生物活性化合物。b. 三步化学-酶法级联反应合成含氟l-α-氨基酸示意图。
醛缩酶NahE在萘分解代谢途径中天然催化水杨醛和丙酮酸可逆转化为反式O-羟基苄基丙酮酸，具有所需的不饱和酮酸结构，因此，作者选择NahE催化含氟苯甲醛底物生成β，γ-不饱和-α-酮酸。随后利用氧化脱羧过程得到相应的肉桂酸产物。通过优化丙酮酸钠浓度和反应时间，在加入80 mM丙酮酸钠反应3小时的条件下，化合物3-氟苯甲醛（1a）的转化率提升至92%。随后向反应体系中加入过氧化氢，淬灭醛缩反应的同时氧化脱羧，得到对应的丙烯酸产物3-氟肉桂酸（4a），产率可达98%（图2）。![]()
图2 醛缩酶NahE和双氧水的连续反应结果
研究选取了一种常用的苯丙氨酸解氨酶，AvPAL，将含氟肉桂酸胺化成相应的氨基酸产物。作者对胺化反应的影响因素进行了探究，其中，酶浓度和反应时间对4a的转化率都没有显著影响。当硫酸铵浓度从0.5 M提高至4 M时，4a的转化率提高了2.4倍。作者进一步使用文献报道的3个AvPAL突变体（AvPAL-C503S/C565S/M222L，AvPAL-C503S/C565S/M222L/T102E，AvPAL-C503S/C565S/M222L/T102E/N453G）催化反应，以期提高胺化反应的转化效率。实验结果表明，3个突变体催化l-苯丙氨酸裂解反应的效率与文献报道一致，但胺化效率没有明显提高，说明可逆的还原胺化反应偏向于胺裂解，本研究在随后的化学-酶级联反应中仍使用野生型AvPAL（图3）。为简化操作流程，本研究将前两步的反应液与AvPAL在硫酸铵缓冲液中混合，通过调整反应液稀释倍数和铵离子浓度对反应体系进行优化。实验结果表明，4a的转化率随前两步反应液稀释倍数和铵离子浓度的增加呈现上升趋势。当前两步反应液稀释倍数为1：4、(NH4)2SO4浓度为2.7 M时，胺化反应的转化率优化至79%，含氟氨基酸产物5a的eeL%>99%。![]()
图3 苯丙氨酸解氨酶反应结果
作者进一步将本研究的化学-酶法体系应用于其他含氟芳香醛类底物，以扩展立体选择性合成含氟氨基酸的范围。如图4，实验结果表明，本研究所开发的方法对于不同的含氟芳香醛类底物具有一定的普适性，共得到9种含氟苯丙氨酸产物，eeL为86%~ >99%，得到5种含氟芳杂环丙氨酸产物，eeL为55%~ 80%，具有良好的工业应用前景。![]()
图4 三步化学-酶法级联反应合成含氟L-α-氨基酸产物扩展。
最后，本研究利用全细胞催化进一步简化分离纯化过程，对化合物3-氟-l-苯丙氨酸（5a）、2,4,5-三氟-l-苯丙氨酸（5e）和4-三氟甲基-l-苯丙氨酸（5g）进行了全细胞半制备级合成，这三种化合物分别为抗肿瘤药物、抗糖尿病药物和HIV蛋白酶抑制剂合成的关键中间体，具有良好的工业应用前景。实验结果如图5，产物5e分离收率最高，可达102 mg/25 mL，立体选择性为97% eeL，产物5a和5g的分离收率分别为15 mg/25 mL和8 mg/25 mL，立体选择性分别高达 99% 和 98% eeL。![]()
图5 L-α-氨基酸的制备级反应。
本研究开发了一种简单、高效、成本低廉的含氟l-α-氨基酸合成方法，该方法在温和条件下实现了含氟芳香l-α-氨基酸的高效合成，产物具有高对映选择性，为医学和生化研究提供了一系列含氟小分子砌块，表明了其在药物开发中的巨大潜力。此外，这种方法还可用于合成位点选择性氟修饰的非天然氨基酸库，作为含氟生物活性分子合成的底物库和蛋白质、多肽的结构-功能研究的探针，为生物医药和化学合成领域提供了重要的应用前景。
