生物催化是现代有机合成化学中的重要领域，通过酶和细胞催化剂提供出色的选择性。这些酶在温和的水环境中工作，促进了高效且可持续的过程。随着测序技术、定向进化、计算机辅助设计等领域的进展，生物催化的范围不断扩大。天然产物的生物合成途径提供了许多新型野生型酶，这些酶在复杂结构的修饰中起着关键作用。化学或多酶级联反应可以显著简化复杂高附加值化合物的合成。手性饱和含氧杂环（CSOHs）是生物活性天然产物的重要结构元素，分子内氧杂迈克尔加成（intramolecular oxa-Michael addition，IMOMA）反应可以选择性地形成这些结构。尽管IMOMA具有很高的合成价值，但实现普遍适用的对映选择性IMOMA仍是一个重大挑战（图1）。
IMOMA 催化的环化酶 (CYCs) 在多种生物合成途径中被发现，并展示出巨大的合成潜力，尤其在四氢呋喃 (THF) 和四氢吡喃 (THP) 目标的合成中。最广泛研究的 IMOMA CYC 是 AmbDH3，其在天然产物合成中表现出强大的立体选择性和立体异构体识别能力。然而，IMOMA CYC 作为生物催化剂的应用面临着两个挑战：首先是需要复杂的手性前体，这增加了合成步骤并降低了其选择性优势；其次，大多数 IMOMA CYC 作用于与酰基载体蛋白 (ACP) 结合的生物合成中间体，而替代 ACP 的 SNAC 硫酯由于其活性及复杂性质，可能会限制其在合成中的应用（方案1）。
作者首先将 AmbDH3 与 R-选择性醇脱氢酶 (ADHs) 结合，以在原位选择性还原7-酮烯硫酸盐来提供有效的环化酶前体，解决了现有单酶反应的局限性。这种双酶反应不仅依赖更易获得的前体，还能充分利用环化酶的高选择性，从而显著提高这种酶的应用价值，并为 CSOH 合成提供了一种新的高选择性替代方法。研究发现，合成的7-酮-2-烯硫酸盐（17b−17i）在 ADHs 作用下能够高效转化为相应的 (7R)-醇，并表现出优异的选择性和高转化率，这表明 ADH 催化的生物模拟 SNAC 硫酯还原反应首次成功实现（表1，图2）。
通过在醇脱氢酶 (ADH) 反应中加入AmbDH3，作者建立了 ADH-CYC 级联反应，并取得了良好的转化率和立体选择性。这种双酶级联反应在较高底物浓度下仍然保持高效，适用于多个底物，并能在温和条件下合成多种含有多个立体中心的 CSOH 产品。尽管对疏水性硫酯的转化受限，使用 SNAC 硫酯作为底物显示出较好的适应性。未来，可以通过筛选具有匹配特异性的 ADHs 或采用已知的 ADH 组合来优化此反应，并扩展其适用范围（表2，图3）。
对双酶反应的可扩展性进行了研究，结果表明 AmbDH3 的单酶反应在较大规模下转化率显著下降，但使用表达裂解液而非纯化酶可以克服这一问题。通过在不同规模上测试三种酶制备方法，发现在 100 mg 规模下，使用体内生物催化剂的反应转化率达到 86%，并且还能够回收几乎全部的 ADH（表3）。
通过对由ADH-AmbDH3反应得到的SNAC CSOH硫酯进行衍生化反应，展示了这些硫酯作为手性THP构建块前体的多功能性。研究发现，PikTE和mmCAR等酶可用于进一步扩展ADH-CYC级联反应，实现一锅多步合成CSOH羧酸和醇。这表明PikTE不仅能水解复杂的聚酮硫酯，也能应用于更小分子量的硫酯，为多酶级联反应中的CSOH合成提供了新途径（方案2）。
CSOH羧酸盐在天然产物中广泛存在。通过三酶级联反应合成了一种天然产物(−)-灵猫香醇乙酸酯(31)，该化合物用于香水行业。研究表明，该三酶级联反应不仅提高了整体合成效率，还避免了对手性试剂的依赖，并可控制C-2位的额外立体中心。此外，灵活的底物特异性使得该方法具有潜力用于合成31的多种衍生物（方案3）。
综上，作者开发了一种可扩展的双酶一锅反应，即 ADH 和 IMOMA CYC AmbDH3，以从易于获取的前手性或外消旋酮烯硫酸酯前体中生产 CSOH 硫酯。由于 IMOMA CYC 的独特选择性，该级联可同时获得 THP 和 THF，并可在一次合成操作中前所未有地控制多达四个立体中心的绝对构型。获得的 THP 硫酯可轻松转化为有用的合成构件。双酶级联可扩展，可直接获得天然产物和手性 THP 羧酸构件，如 (−)-civet、新衍生物 23 和 THP 醇 26 所示。通过改变 ADH− CYC 对并将它们与其他酶或合成反应相结合，应该可以将这种方法的范围扩大到广泛的 CSOH 构件。我们的工作是将复杂的支架形成酶从次级代谢发展为多功能生物催化工具的一个例子，这种发展在合成上极具吸引力，但很少实现。如果这些酶能够整合到专门调整的方案中，它们有望实现新的、高效的合成策略。
作者信息及链接：
Frank Hahn：https://www.oc-hahn.uni-bayreuth.de/en/index.html
研究方向：1. 天然产物合成；2. 生物合成；3. 生物催化
文章信息：Highly Stereoselective Biocatalytic One-Pot Synthesis of Chiral Saturated Oxygen Heterocycles by Integration of a Biosynthetic Heterocyclase into Multiple-Enzyme Cascades
文章链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.4c03692
