期 刊: ACS Catalysis
论文标题：Designing ASSMD Strategy for Exploring and Engineering Extreme Thermophilic Ancestral Nitrilase for Nitriles Biocatalysis
作者信息：第一作者：汪子凯(公众号DNA解悬媒作者，江南大学在读博士生)；通讯作者：龚劲松(江南大学), 陆震鸣(江南大学）
酶的热稳定性对于延长反应时间和可重复使用性至关重要。极端酶以其高热稳定性而闻名，在生物催化领域被广泛关注。极端酶在极端条件下进化，可能在适应当前环境的进化过程中已经灭绝。幸运的是，祖先酶序列重构可以通过计算机算法推演出现有酶的祖先酶序列。在这里，我们设计了ASSMD策略，以揭示进化景观中已灭绝祖先酶的分子信息。随后，该策略被应用于探索极端祖先腈水解酶的研究工作中。在进化景观中，我们发现了一个动力学柔性洼地。在洼地中，我们获得了祖先酶ASR135，这是一种能够耐受90°C的祖先腈水解酶。结合进化分析和人工进化，我们在该进化事件中实现了ASR135热稳定性的人工进一步提升，并获得了突变体ASR135-M4（S97E/S101A/N124H/H155Y），其能在100°C下表现出水解活性。机制解析表明，ASR135-M4表现出盐桥、氢键和π-烷基相互作用四面体笼的增加，并增强了蛋白质内部的疏水核心。这些改变使得四个二级结构之间的相互作用网络更加稳健。总的来说，ASSMD策略具有发现高性能腈水解酶，特别是极端酶的潜力。
研究内容
本研究中，为了揭示进化景观的分子水平信息，作者设计了一个构建祖先酶序列-结构-动力学参数库的工作流，其被称为ASSMD策略（图1）。
图1| ASSMD工作流创建
随后，该策略被用于挖掘极端嗜热祖先腈水解酶的研究中。腈水解酶可以催化腈类化合物水解成羧酸，被广泛应用于食品、制药和化学工业等各个领域。首先，使用系统发育树展开腈水解酶的进化历史，以创建祖先酶序列库，其中包括69个代表树根和分支的祖先酶序列。研究发现，基于ASSMD策略，腈水解酶进化景观中存在一个动力学柔性洼地（该区域的祖先腈水解酶的RMSD值明显低于其他区域），包括七种祖先酶（图2）。
图2|腈水解酶进化景观中存在动力学柔性洼地
进一步对这些祖先酶进行实验表征，发现了一种极端嗜热的祖先酶ASR135，能够耐受高达90°C的高温（图3）。
图3|祖先酶活性与热稳定性表征
为了更深入地了解其进化信息，通过结合能量计算和实验室进化，对其进化事件进行了进一步分析（图4）。
图4|祖先酶进化事件分析与突变体文库构建
基于人工进化进一步增强了ASR135的热稳定性，获得了一种突变体ASR135-M4，即使在沸水温度（100°C）下也能表现出水解活性（图5）。
图5| 人工进化祖先酶耐受沸水温度
进一步的研究表明，ASR135-M4在经过实验室进化以提高其热稳定性后，在其结构中表现出额外的盐桥、氢键、π-烷基相互作用四面体笼和增强的疏水核心，表现出鲁棒性强的相互作用网络（图6）。
图6|祖先酶热稳定性提升机制解析
为充分挖掘本研究中所探究的祖先酶的应用潜力，我们探究了祖先腈水解酶的底物谱（图7）。发现了该祖先酶具有明显的芳香腈类的底物偏好性。
图7| 祖先腈水解酶底物谱
最后，我们对这种腈水解酶的芳香腈底物偏好性进行了机制解析，成功发现了一种活性中心CYS与底物的“指向/背向”机制。这种机制展示了芳香/脂肪腈被亲核进攻的概率差异，从而导致腈水解酶对两种底物的底物偏好性差异（图8）。
本文转载自：DNA解悬媒
