图1. 生物催化剂开发的常用策略及本研究中的目标生物催化合成方法，有望丰富azaphilone的化学空间。(A) 策略包括筛选野生型酶、定向进化，以及使用计算工具（如共识序列、ProteinMPNN、酶设计和生物信息学引导的祖先序列重建）。(B) 通过筛选合适的黄素依赖单加氧酶和酰基转移酶，实现了线性三环azaphilone的立体互补化学酶合成。(C) 基于azaphilone上R1、R2和R3基团的多样性，立体互补性使组合数量加倍，从而增加了化学多样性。
图2. 基于azaphilone生物合成基因簇（BGCs）中黄素依赖单加氧酶（FDMO）与酰基转移酶（AT）的共定位及上下游关系的酰基转移酶筛选。(A) 已深入研究的azaphilone相关BGCs。(B) 展示FDMO和AT之间的酶级联反应顺序关系。(C) 通过三个FDMO-AT聚类对展示FDMO和AT聚类之间的一致性，并以调整后的互信息（AMI）得分量化。(D) AT筛选流程，起始于AfoD的BLAST搜索，随后识别与AfoD相邻同源蛋白共存的AT。接下来的筛选流程分为基于祖先序列重建（ASR）的方法和以野生型酶为模板的蛋白质工程方法。
图3. 基于生物信息学指导的CazE祖先序列空间采样与祖先酰基转移酶（ATs）的复活。(A) 在chaetoviridin A (8) 的生物合成基因簇中，报道的CazL/CazE（FDMO/AT）顺序，从10到11再到8。(B) 使用两种酶顺序合成线性三环azaphilone。(C) 使用最大似然法重建的系统发育树。(D) 复活的ATs的初步研究。
文章信息：Ancestral Sequence Reconstruction to Enable Biocatalytic Synthesis
of Azaphilones
文章链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c08761
