手性α-氨基酯是一种重要的非典型氨基酸来源，可用于药物开发和生物分子功能的引入。虽然现有的方法在合成α-氨基酯时面临挑战，但通过利用氢氧胺衍生试剂和工程化细胞色素P450，可以将多种C−H键转化为初级胺。研究表明，氮烯转移酶在氨化过程中能促进与羧酸酯的α-C−H氨化反应，为此作者进行了定向进化以发现能够催化此反应的血红素酶（方案1）。
研究团队首先组装了两种有用的血红素蛋白库，用于氮烯和卡宾转移反应。其中包括96种工程化的细胞色素P450氮烯转移酶和60种来自极端环境生物的较小血红素蛋白。通过高通量筛选，仅发现一种能够进行乙基2-(4-氟苯基)醋酸酯的α-C−H氨化反应的生物催化剂，即来自Aeropyrum pernix的热稳定原球蛋白（ApPgb）。该酶经过八轮定向进化（directed evolution，DE），将反应产物的产率提升至41%，选择性达到84%。随后，通过对酶的突变体进行高通量筛选和序列分析，进一步优化了酶的活性和选择性，最终得到L-ApPgb-αEsA-G11变体，产率和选择性分别为50%和96%。此外，针对D-非典型氨基酸的研究中，经过两轮DE，变体D-ApPgb-αEsA-G2的产率提高至62%，选择性为72%（图1）。
L-ApPgb-αEsA-G11和D-ApPgb-αEsA-G2在多种羧酸酯的底物适应性方面表现出色，能够合成包含甲基、乙基和异丙基酯的α-氨基酯。它们对取代的乙基苯乙酸酯具有良好反应性，包括多种卤素和甲氧基取代基。此外，二取代的α-氨基酯也被成功合成。两种酶在氨化烷基羧酸酯方面显示出微弱活性，为未来的定向进化提供了新方向。使用L-ApPgb-αEsA-G11进行的模型反应在1 mmol规模下获得了55%的产率和96%的选择性。最终，这些进化后的酶能够合成氯吡格雷的中间体，展现出良好的手性选择性。L-ApPgb-αEsA-G11对卤素取代的芳香羧酸酯具有优异的选择性，而D-ApPgb-αEsA-G2则在产率上表现更佳，为后续的选择性改进奠定了基础（方案2）。
定向进化（DE）实验创建了酶变体库，展示出不同的底物特异性和选择性。为了识别对富电子取代芳香羧酸酯具有更好选择性的酶，研究团队整理了70种在DE过程中筛选出的酶突变体，并使用开发的检测方法评估其合成14的能力。结果显示，部分酶的活性和选择性优于L-ApPgb-αEsA-G11，特别是L-ApPgb-αEsA-G10-3在45%的产率和86%的选择性下成功合成了14。同时，L-ApPgb-αEsA-G9也表现出更高的产率和选择性，用于合成13a和15a。这个变体库为进一步优化氨化反应中的目标底物提供了基础（图2）。
综上，本研究开发了可催化羧酸酯的对映选择性分子间α-C−H一级胺化的氮烯转移酶，从而能够合成未受保护的手性α-氨基酯。高通量分析对于开发用于L-α氨基酯合成的高对映选择性酶和发现有利于 D-α-氨基酯的酶至关重要，该分析评估了突变酶的活性和对映选择性。工程酶提供了有价值的底物范围，包括获取用于合成活性药物成分的中间体。值得注意的是，它们在有氧条件下在室温下运行，而以前的氮烯转移酶则需要厌氧环境或低于环境温度才能发挥最佳性能。这项工作扩大了已知进行酶促胺化的底物，并展示了酶活性位点可以通过 DE 重塑的程度。预计这些酶将促进其他质子C-H键的功能化，从而合成重要的手性胺。
作者信息及链接：
Frances H. Arnold：fhalab.caltech.edu
研究方向：蛋白质和酶工程
文章信息：Biocatalytic Synthesis of α-Amino Esters via Nitrene C–H Insertion
文章链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c09989
