在没有NADH时，CV曲线显示仅有FcCA的氧化还原峰，氧化电流密度为0.18 mA/cm²。当加入NADH后，FcCA的氧化电流密度显著增加到0.73 mA/cm²，说明LmNOx酶参与了NADH氧化，FAD通过FcCA+在电极上再生。此外，FcCA+的还原峰消失，表明其在酶催化循环中被消耗。这些结果证实了通过FcCA介导的电子转移，实现了FAD在酶活性位点的再生。相比之下，自由酶溶液中NADH的电化学氧化没有显著影响，但在LmNOx固定化电极上，FcCA氧化峰显著增强，进一步验证了该酶催化机制（图3）。
观察到的NOx生物电催化活性源于酶在GC电极上的固定化，而不是简单地将酶溶解在电解液中。SEM图像中的CTS网络结构提供了一个将酶与电极紧密接触的基质，有助于在酶活性位点实现高效的电子转移。因此，电极通过FcCA+向FcCA的酶促转化间接促进了FADH2的氧化，导致还原峰消失和氧化峰增加。此外，NADH的电催化氧化起始电位增加，表明由于酶的结合，电极表面附近的NADH局部浓度降低。这些结果进一步证实了一个电化学辅助的LmNOx生物催化系统的成功构建，使NADH的氧化能够在无氧条件下连续进行（图2）。
我们首先对野生型LmNOx进行了500纳秒的分子动力学（MD）模拟，分析了O2结合通道沿途腔体的动态变化。图4A显示了蛋白质中腔体在整个轨迹中出现频率超过60%的区域，表明了氧气结合到活性位点的路径。可以看出，尽管Leu40远离活性位点并且不直接参与NOx的氧化还原循环，它在氧气通道中起到了通道门控的作用。随后，我们对Leu40突变体进行了进一步的分子动力学模拟，发现Leu40Trp（L40W）突变体中的氧气通道开启频率降低到不足20%，这表明Trp40的大型吲哚侧链可能抑制了氧气向活性中心的扩散（图4）。
将三种突变酶固定在GC电极上的生物电催化活性与野生型LmNOx进行了比较，分别在饱和氩气和暴露于空气中的条件下进行实验。在厌氧条件下，酶循环的第二阶段，即辅因子FAD再生的内在活性受到抑制。插入突变酶的电极上记录的FcCA介质氧化电流峰在空气和氩气暴露条件下几乎没有变化，这与野生型酶电极（灰色曲线）形成了鲜明对比。这些观察表明，原生酶通过氧气通道进行的电催化竞争在三种突变体（L40W、L40W/C42A、L40W/C42G）中均得到了有效抑制。然而，所有三种突变体的电催化效率均有所降低，FcCA氧化水平较野生型酶降低了79%至39%不等。其中，L40W/C42A双突变体的恢复结果最为理想，在氩气饱和电解液中，其最大电流密度为野生型的79%。空气中的氧气对L40W/C42A固定电极的电催化影响相对较小，相较厌氧条件下仅降低了3.5%（图5）。
最后通过电化学阻抗谱（EIS）测量展示了酶固定电极的电催化动力学行为。图6A显示了野生型LmNOx/CTS@GC在不同电位下的奈奎斯特图，1.0 V电位下半圆最小，表明电荷转移电阻最低，与其优越的催化活性一致。图6B显示了突变体在1.0 V电位下的奈奎斯特图，L40W/C42A双突变体的半圆最小，表明其电荷转移电阻最低，催化活性最佳。
作者信息及链接：
高加力：jialigao.org/people/jiali-gao.html
研究方向：基于动力学模拟的结构和能量学分析对酶促反应的理解
杨世和：https://web.pkusz.edu.cn/chsyang/?page_id=2
研究方向：致力于研究物质从原子、分子过渡到凝聚态的中间形态(团簇和低维纳米材料)的结构、性质及应用
文章信息：Engineering Oxygen-Independent NADH Oxidase Integrated with Electrocatalytic FAD Cofactor Regeneration
文章链接：https://doi.org/10.1021/jacsau.4c00528
