P450单氧化酶（P450s）是一类有吸引力的生物催化剂，广泛用于氧化反应，尤其是对活化C−H键的羟基化和烯烃的环氧化。然而，针对未活化烯烃的直接手性环氧化仍然具有挑战性，因为其反应活性低且难以控制手性。最近发现了来自Deinococcus apachensis的P450单氧化酶（P450DA），能够高选择性地催化羟基化反应。通过结构引导的定向进化，本研究成功开发了P450DA突变体，显著提高了对未活化烯烃的环氧化选择性，并实现了同时合成两种手性环氧化物（图1）。
研究发现，P450DA中位于血红素顶部的F90和I331残基在控制苯甲酸甲酯和卤代烯烃的C−H键立体选择性中起关键作用。作者调查了这两个残基对未活化末端烯烃选择性氧化反应的影响。通过饱和突变文库构建，筛选出两个突变体P450DAER1和P450DAES1，它们成功地将选择性从羟基化转变为环氧化，并分别获得手性环氧化物(R)-3a和(S)-3a。然后通过工程改造P450DAER1并采用迭代饱和突变策略，提高了环氧化选择性。突变体I331F/I265A（P450DAER2）将选择性提升至91%。后续多个突变体（如P450DAER3T、P450DAER3E等）进一步增强了R选择性环氧化，表明I265及其他残基在底物进入活性中心中起关键作用。接下来通过迭代饱和突变策略构建了P450DAES1突变体，以实现S选择性环氧化。经过五轮演化，关键残基的突变使得环氧选择性超越了原模板，其中P450DAER4TL对(R)-3a的选择性比为>1:99，P450DAES5对(S)-3a的选择性比从97:3提升至5:95。（图2）。
通过定向进化和P450DA结构分析，发现I81和M187对(R)-3a和(S)-3a的选择性均有影响。在P450DAER5中，I331变为较大的氨基酸，而I81、M183、M187和I265变为较小的氨基酸，增加了F90和I331之间的空间，有利于(R)-3a选择性。相反，P450DAES5中I81和M187变为较大的氨基酸，Y78和F90变为较小的氨基酸，增强了(S)-3a的选择性。最终，P450DAER5和P450DAES5分别接受了八个和九个突变，实现了从苯基C−H羟基化到C=C键环氧化的功能转变（图3）。
P450DAER1和P450DAES1成功生成高对映选择性的(R)-和(S)-环氧化物。I331F突变显著提高了R选择性，使(R)-3a的对映体比达到94:6，而F90I突变则显著增强了S选择性。F90和I331对底物1a的氧功能化选择性和立体选择性至关重要。通过200 ns的分子动力学模拟，验证了底物1a的化学选择性，并发现P450DAER5和P450DAES5突变体的C1更接近血红素中心。模拟结果显示(R)-环氧化物来自Re面，(S)-环氧化物来自Si面，且与实验结果一致（图4）。
进化后的突变体成功对单取代末端烯烃进行环氧化，生成高选择性的(R)-和(S)-环氧化合物。分子对接分析显示，P450DAER突变体的活性中心更紧凑，稳定了底物的C=C键位置，保持高选择性。P450DAES突变体的空间较大，导致选择性降低。总之，进化后的P450DA酶在底物处理时展现出完整的环氧化选择性（图5）。
为评估进化变体在药物化学中的应用，使用P450DAES5的全细胞在5 mM底物浓度下环氧化1a，获得(S)-3a的产率为40%，对映体比95:5。利用(S)-3a合成了三类化合物，可作为生物活性化合物或药物的关键部分，展现了手性单取代末端环氧化物的应用潜力（图6）。
文章信息：P450DA Monooxygenase-Catalyzed Chemoselective and Enantiodivergent Epoxidation of Unactivated Alkenes
文章链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.4c04941
