中科院天工所崔成森/微生物所王罗医 OL 工程亚胺还原酶催化烷基化苯丙胺的对映体合成

文摘 2024-09-09 17:46 浙江

摘要

小体积酮对M5（来源于A.hymeniacidoni的工程化亚胺还原酶突变体）表现出较低的立体选择性，因为它们难以限制亚胺中间体的自由旋转。本研究从M5获得了具有催化活性的工程对映体互补亚胺还原酶，确定了四个在控制立体选择性方面发挥重要作用的关键残基。获得了两个突变体I149Y-W234L（高达99%S ee）和 L200M-F260M（高达99%R ee），对测试的底物表现出出色的立体选择性，为合成烷基化苯丙胺提供了有价值的生物催化剂。

研究内容

烷基化苯丙胺及其衍生物通过增加大脑中去甲肾上腺素、血清素和多巴胺的水平，广泛用于治疗注意力缺陷障碍、注意力缺陷多动障碍、创伤性脑损伤、嗜睡症和慢性疲劳综合症等。目前常用药物包括(S)-苯甲苯丙胺、(R)-司来吉兰、(S)-赖地非他明和(R)-福莫特罗（图1）。

图1. 含有烷基化苯丙胺及其衍生物的代表性药物化合物

由于烷基化苯丙胺衍生物的重要性，已经开发了多种合成和衍生化方法，但这些化合物的立体中心易于发生消旋化，因此需要抑制消旋化的方法，同时满足高产率、高选择性和低成本的要求。传统的化学方法虽被广泛应用，但仍未完全满足所有标准。近年来，IREDs（亚胺还原酶）被用于还原亚胺化合物，并展现了在不对称还原胺化中的潜力。为了提升其工业应用潜力，进行了酶的定向进化。2022年，作者通过定向进化开发了高效、R选择性的IRED突变体M5，并通过结构指导设计进一步优化其催化选择性。

研究通过饱和突变和组合突变优化酶的立体选择性，发现M147W和M147Y突变体在S选择性中表现最佳，ee值分别为84%和82%，而I149Y/W234E组合变体达到了99%S的ee值并显示出最佳活性。对于R选择性，F260C、F260M和L200M突变体表现出最高的R选择性，但大多数突变体活性下降。最终，F260M/L200M组合突变体实现了99%R的ee值，但活性比最佳S选择性变体低15%（表1）。

表1. 用于合成 (R)- 和 (S)-1a的催化还原胺化的组合突变体

为了初步解释突变体的立体分化现象，研究人员通过分子模拟和动态模拟分析了I149Y/W234L (YL)和F260M/L200M (MM)突变体的酶-底物复合物。分子动力学模拟显示，两个复合物的构象在30 ns后逐渐稳定。模拟结果表明，I149Y的苯丙基自由旋转受限，导致S-氨基丙苯的生成，而F260M/L200M的突变在活性位点形成了阻碍，限制了中间体的构象，导致R-产物生成。同时，F260M和L200M突变增加了底物与氨基受体结合位点的距离，解释了MM变体活性的下降（图2）。

图2. MD模拟

随后，研究评估了两种立体互补突变体MM和YL对不同类型和体积的氨基供体的催化性能。结果显示，YL对大部分氨基供体的转化率超过90%，尤其是与1a结构相似的1k和1l的对映选择性分别达到了97%S和99%S。而MM催化的氨基供体产物的对映选择性普遍优于YL，大多数超过90%R，但对扩展的氨基供体催化活性有所下降。总体而言，MM和YL在对较小体积酮供体进行立体控制时表现出了一定的挑战（图3）。

图3. 用于不对称合成烷基苯丙胺衍生物制备规模的底物范围

M5突变体为将烷基化苯丙胺类化合物多样化为其他具有生物活性的药物化合物提供了很好的平台。通过IRED催化的还原胺化反应，苯丙酮衍生物1和2可以转化为多种药物中间体（方案1）。

方案1. 苯丙胺衍生物及医药中间体的合成

综上所述，作者通过设计IRED催化的不对称还原胺化反应，构建了一个用于R-和S-烷基化苯丙胺及其衍生物的对映体合成的生物催化平台。基于结构分析、半理性设计和机理研究，研究了立体选择性修饰的关键热点，这些修饰对于空间位阻较小的酮底物至关重要，因为限制活性口袋中的自由旋转是比较困难的。关键活性位点的协同作用对控制活性位点上的Pro-(S)或Pro-(R)构象起着至关重要的作用。两种组合变体I149Y-W234L和L200M-F260M，它们具有增强和反向的立体选择性，ee值分别高达99%-S和99%-R。此外，这两种突变体对一系列烷基化苯丙胺及其衍生物都表现出良好的转化率和立体选择性，证明了策略的有效性。其合成潜力通过药物关键中间体苯丙胺、司来吉兰和福莫特罗的多样化得到证明。本文的蛋白质工程扩大了M5突变体的催化范围，并提出了一种潜在的绿色和可持续的合成方法来获取具有工业意义的手性烷基化苯丙胺及其衍生物，尽管某些供体的酶活性需要进一步提高。

论文相关信息

作者信息及链接：

崔成森：www.tib.cas.cn/sourcedb_tib_cas/cn/expert/rckyjy/202205/t20220526_6454309.html

研究方向：挖掘并改造天然产物生物合成途径中的酶分子，通过理性设计赋予其高转化率、高区域和立体选择性。开发以人工酶介导的新颖酶促反应，发展化学-酶法药物分子的绿色、可持续、高效的合成新路线，并积极推进产业化

王罗医：https://www.im.cas.cn/jgsz2018/yjtx/gywswyswjsyjs/202012/t20201209_5813906.html

研究方向：黏细菌基因编辑技术开发、黏细菌天然产物资源挖掘与生物合成

文章信息：Engineered Imine Reductase Catalyzed Enantiodivergent Synthesis of Alkylated Amphetamines

文章链接：https://doi.org/10.1021/acs.orglett.4c02600

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