河北科技大学 陈启佳 IJBM 结合立体互补的D-和L-乳酸脱氢酶的多酶级联一锅法不对称合成手性苯乳酸

文摘   2024-09-01 16:07   浙江  

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摘要
手性苯乳酸 (phenyllactic acid,PLA) 是一种新型防腐剂,也是药物和农用化学品中活性成分的宝贵前体。本研究设计了一种多酶级联,将立体互补的D-和L-乳酸脱氢酶与苏氨酸醛缩酶、苯丝氨酸脱水酶和甲酸脱氢酶相结合,用于将非手性甘氨酸和苯甲醛一次性转化为 D-PLA 和 L-PLA。为了克服单个细胞中多酶的不平衡,在大肠杆菌细胞中组装了两个酶模块,过量表达四种酶,以构建全细胞催化系统 (whole-cell catalysis systems,WCCSs)。此外,通过优化反应条件和成分,重组大肠杆菌 (WCCS 26) 能够使用补料分批策略生产 100 mM D-PLA,ee值>99%,而大肠杆菌(WCCS 60)则生产47.2 mM L-PLA,ee值>99%。本研究提出了一种可持续且有效的方法,用于从食品级非手性起始材料合成手性PLA。


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研究内容

该研究通过生物催化逆合成分析确定苯甲醛和甘氨酸为合成手性苯乳酸的合适起始材料,并设计了多酶级联反应。反应包括两部分:首先通过转氨酶(TA)催化醛醇加成和PSDH催化脱水反应生成前手性PPA。接着,通过乳酸脱氢酶(LDHs)催化的不对称氢化反应以及FDH或GDH催化的NADH再生,将PPA转化为d-PLA或l-PLA。与使用氨基酸作为底物的“Phe-PPA-PLA”合成途径相比,这种策略具有更好的多样性与潜力(图1)。


图1. 手性PLAs的合成策略


在单细胞中共表达多种酶时,由于酶的活性和表达水平差异会导致表达失衡。为此,作者采用双质粒共表达策略,利用不同拷贝数的兼容质粒在大肠杆菌中组装了四个酶模块1和三十二个酶模块2-5,构建了96个大肠杆菌菌株(WCCS 01-96)。筛选结果显示,菌株WCCS 26(E-M1_R-M2b)和WCCS 60(R-M1_A-M4a)分别在d-PLA和l-PLA的转化中表现优异,转化率分别为34.4%和28.1%,对映选择性均超过99%。此外,选择使用FDH而非GDH作为辅因子再生系统,因为FDH利用低成本的甲酸再生NADH,仅生成易分离的二氧化碳,避免了GDH产生的副产物和pH控制需求(表1图3)。

表1. 含有不同酶模块的重组大肠杆菌菌株的遗传构建

图3. 用于生物合成D-PLA和L-PLA的WCCSs的筛选

在一锅合成中,为了转化生成PLAs,对多种反应条件进行了优化(图4)。


图4. WCCSs的反应条件优化


为了评估全细胞生物合成策略的适用性,反应在50 mL反应液中进行了最优反应条件下的实验。与1 mL反应系统相比,在12小时的补料分批反应过程中检测到少量的PPA,并在将反应时间延长至15小时后,底物完全转化为D-PLA。L-PLA的制备性生物转化与1 mL反应系统类似,产率达到94.2%。D-PLA和L-PLA的对映体过量值均超过99%,分离产率分别为73.5%和70.6%。这些结果表明,这些WCCSs有望优化用于大规模生产(图5)。

图5. 重组大肠杆菌WCCS 26和WCCS 60将苯甲醛和甘氨酸生物转化为D-PLA 和L-PLA的时间过程
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论文相关信息

作者信息及链接

陈启佳:https://sgxy.web.hebust.edu.cn/yjsjy/dsdw/swyyyds/e5c27010b2044bcd92531a887149100b.htm

研究方向:1. 新型生物催化剂的发现、分子改造及应用研究;2. 食品合成生物

文章信息:One-pot enantioselective synthesis of chiral phenyllactic acids by combining stereocomplementary d- and l-lactate dehydrogenases with multi-enzyme expression fine-tuning

文章链接:https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2024.135133

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