传统上，OYEs通过生物-生物乒乓机制不对称还原活化烯烃。近期发现，OYEs在肟还原中表现出独特的两步机制，相关研究还显示了不同OYE的活性，但缺乏产物和对映选择性的信息。本研究详细描述了EREDs对α,β-二羰基化合物的还原反应及其机制，为生产手性α-羟基羰基提供了有价值的模板（图1-2）。
本研究对十种α,β-二羰基化合物进行了不对称生物还原的初步筛选，使用了六种烯还原酶（EREDs）和一种双键还原酶。通过热或亲和层析法纯化所有酶，发现使用葡萄糖脱氢酶（GDH）作为辅因子回收系统可以有效还原α,β-二羰基，且转化率和对映选择性各异。GluER显示出在还原直链脂肪族底物方面的多样性，能够将其转化为单还原的α-羟基羰基化合物。其他酶对环己二酮的还原效果不佳，芳香二酮和酮醛则表现出不同的转化率。进一步扩展筛选后，发现多种EREDs均能生成手性羟基酮产物，尤其是LeOPR1的转化率高达94%。多个酶以(R)-选择性生产主要产物7b，并伴随少量(S)-异构体7c，表明存在两种不同的还原机制。总体而言，OYE3在对映体和区域选择性方面表现最佳（图3-4）。
然后探讨了OYE3对芳香二羰基化合物7a的单还原反应，发现不同辅因子在有氧和无氧条件下均能实现91%至100%的高转化率，生物转化的对映选择性达97% ee。利用NADPH进行的动力学测定显示kcat值为0.71 ± 0.03 s−1，Km值为2.46 ± 0.25 mM。对于酮醛苯乙醛8a，主要产物为β-羟基羰基8c。其他取代芳香化合物的测试结果显示，部分底物实现了高转化率和良好对映选择性（表1-2）。
最后分析了OYE3催化的二羰基化合物7b的单还原反应，未发现自由基信号，排除了自由基机制。氘标记的NMR结果显示转化率达99%但无氘掺入，表明质子化来自反应介质。OYE3突变体Y197F的低转化率支持该位点的作用。提出的机制为氢化转移至羰基氧后苄基α-碳的质子化，符合之前的还原机制。此外，新解析的OYE2结构显示底物7a与活性位点的结合模式可能影响催化效果（图5-6）。
文章信息：Asymmetric Monoreduction of α,β-Dicarbonyls to α-Hydroxy Carbonyls by Ene Reductases
文章链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.4c04676
