手性芳基β-羟基α-氨基酸及其衍生物是自然和合成生物活性化合物的重要结构组分，例如氟苯尼考在兽医学中的需求量超过4000吨。现有的化学合成方法面临原子经济性差、区位选择性问题以及对昂贵催化剂的依赖等挑战，而酶催化则提供了一种高效且温和的替代方案。动态还原动力学拆分（DYRKR）利用羰基还原酶（CR）对芳基α-氨基β-酮酯进行非对称合成，能够同时引入两个立体中心并实现100%的最大理论转化。然而，关于CR催化的DYRKR的研究仍然有限，存在活性不足和底物范围窄等问题。通过对EaSDR6进行环路工程和计算分析，研究显示突变可以改善底物结合和非对映选择性，为其在工业应用中的潜力提供了基础（方案1）。
作者在先前的研究中，来自微小杆菌的EaSDR6展示了对底物甲基2-((叔丁氧羧基)氨基)-3-氧代-3-苯基丙酸酯的低活性但优良立体选择性。基于其结构相似性，推测EaSDR6也能催化底物1a。实验验证支持了这一假设，显示出EaSDR6对底物1a的适度特异性活性和立体选择性。尽管初步结果令人鼓舞，但EaSDR6的活性和非对映选择性有限，无法满足工业需求。因此，酶的进化成为提高催化性能的有效策略。研究通过结构预测和分子对接分析，识别了关键的残基，并通过突变实验筛选出多个关键位点。随后，通过组合突变策略（CAST/ISM），成功获得了一系列改进的突变体，尤其是突变体M6表现出对底物1a的催化活性提高了19倍。这些结果表明，通过环路工程和系统性突变，显著改善了EaSDR6的催化性能，为工业应用提供了新的可能性（图1）。
研究比较了野生型EaSDR6与突变体（M1-M6）对底物1a的催化性能。结果显示，突变体的特定活性显著提高，M6的活性比野生型增加66倍，Km值降低至0.4 mM，表明其亲和力增强（表1）。手性HPLC分析显示M2-M6的非对映选择性均超过99%，而M1的选择性也提高至84%。结构分析表明，底物1a的大芳香环位于C腔中，影响NADPH对羰基的攻击。与野生型相比，突变体通过结合环改造显著改善了对底物1a的选择性，特别是A190和S193的突变对非对映选择性影响显著。
为探讨突变体M6活性和非对映选择性增强的原因，计算分析显示，S137和K154在催化机制中稳定底物1a并降低酚羟基的pKa值。M6-1a复合物中，关键“催化”距离较野生型更短，且与E205的额外氢键增强了极性相互作用。A190和Y201的突变减小了腔A空间，增加了与酰胺基的疏水相互作用。A138 V突变缩小了腔C体积，并减少了与底物苯基的疏水相互作用距离。分析表明，M6-2S3R在“催化”构象中的比例显著提高，表明其更有利于生成(2S, 3R)-产物。这些结果强调了底物结合口袋的最佳体积和形状，以及酶与底物的相互作用对催化活性的关键作用（图2）。
之前的研究强调了环构象对底物识别、结合和催化的重要影响。通过对催化和底物结合环在最后20纳秒模拟中的Cα-RMSD值进行聚类分析，发现底物结合环通过疏水相互作用稳定底物1a，并将其拉近催化环以促进反应。与野生型相比，M6减少了腔A和C中的额外空间，使底物1a更好地适配活性口袋，因此底物结合环无需额外移动就能稳定底物1a。然而，在模拟过程中，观察到2R构型底物的严重构象翻转，限制了M6生成2R3R构型产物的能力。不同酶-底物复合物的闭合构象比例与活性呈良好相关性，结果表明，特定关键氨基酸突变显著影响催化反应中的构象动态，从而影响底物的亲和力和产物的非对映选择性（图3）。
为探讨六重突变体的活性和非对映选择性，作者采用基于密度泛函理论（DFT）的量子化学簇方法。构建了包括酶-底物复合物和过渡态的模型，分析显示TS-M6-2S3R中的C−H····O和N−H····O相互作用数量较多，底物结合环的改造增强了与acetamide甲基的疏水相互作用，使其更为热力学稳定（ΔΔE = −2.3 kcal/mol），从而促进高效催化。而在TS-WT-2R3R中，结构变化导致的相互作用减弱使其不稳定（ΔΔE = −4.0 kcal/mol）。QM计算进一步证实，底物结合环的工程化降低了反应能量障碍，促进了2S3R构型产物的生成（图4）。
研究了WT及突变体（M1−M6）对12种芳基α-氨基β-酮酯的催化能力。尽管WT的活性口袋能容纳所有底物，但催化活性普遍较差，只有M1−M6在1b、1c、1e和1l上有所提升。使用FuncLib策略设计的突变体（如M9、M12和M24）在多数底物上表现出显著活性，VAF突变体也显示出高立体选择性和良好转化率。分析表明，Boc基团在A腔中的适应性优于其他保护基团，底物的电子效应和空间位阻同样显著影响催化活性，尤其是底物1i因适应腔C的形状而表现良好（方案2）。
为了展示M6的工业应用潜力，进行了克级反应，合成了氟苯尼考的中间体(2S, 3R)-2a。在优化条件下，M6在200 g L⁻¹的底物浓度下，4小时内几乎完成反应，而WT在12小时内仅转化约40%。在300 g L⁻¹的底物浓度下，M6在8小时内实现99%的转化，空间产量高达897 g L⁻¹·天⁻¹。传统方法依赖于苯甲醛和甘氨酸的缩合，效率低，仅41%的分离率，且化学还原需昂贵的过渡金属催化剂，限制了工业应用。相比之下，基于酶促DYRKR的创新路线能实现超过99%的转化和选择性。M6在300 g L⁻¹底物浓度下表现出99%的转化率和高立体选择性（>99% e.e.和d.e.）。不过，由于底物溶解度限制，目前系统无法在更高浓度下催化，未来可能需要开发双相系统或提高酶对有机溶剂的耐受性（图5）。
综上，本研究识别出了一种碳基还原酶（EaSDR6），其对底物1a的特异活性为3.2 U mg⁻¹，且具有59%的非对映选择性。通过对接分析和环工程，确定了底物结合口袋中对活性和选择性至关重要的残基。全面的丙氨酸扫描和CAST/ISM策略后，筛选出表现最佳的突变体M6（A138 V/A190M/S193A/Y201W/N204H/V205E），其特异活性提高至210.2 U mg⁻¹，非对映选择性超过99%。M6在大规模生产氟苯尼考中间体(2S,3R)-2a方面表现出色，300 g L⁻¹底物1a在8小时内实现99%转化，显示出工业应用的潜力。此外，通过FuncLib策略获得的高效突变体VAF（A190 V/S193A/Y201F）在大多数芳基α-氨基β-酮酯上展现出高立体选择性，转化率和分离产率。不同取代基的底物结构-活性关系分析揭示了保护基团和芳香基团对催化活性和非对映选择性的显著影响。分子动力学模拟和量子化学计算阐明了柔性底物结合环的闭合构象在酶催化和非对映选择性控制中的关键作用。总体而言，本研究不仅展示了工程化碳基还原酶在合成手性芳基β-羟基α-氨基酯中的增强能力，还为其在工业过程中的可扩展应用奠定了坚实基础，凸显了生物催化在制药合成中的广泛潜力。
作者信息及链接：
柳志强：https://homepage.zjut.edu.cn/LiuZhiQiang/
研究方向：生物催化与转化、合成生物学
文章信息：A Highly Stereoselective and Efficient Biocatalytic Synthesis of Chiral Syn-Aryl β-Hydroxy α-Amino Esters
文章链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.4c03273
