在Fe(II)/αKG酶超家族中，自由氨基酸羟化酶是工程新反应的理想候选者，因为它们的催化机制能够与氨基和羧酸功能团相互作用。假设这些酶可能对仅含氨基或羧酸的底物具有多重活性，这些底物是多步合成中重要的原料。作者筛选了12种Fe(II)/αKG氨基酸羟化酶，发现其中一种酶tP4H能与羧酸底物1反应，尽管其催化效率明显低于对应的天然底物。通过突变活性位点残基，确认tP4H对非原生反应的贡献，且随酶浓度增加产物产量提升，尽管总体产量仍较低。这些结果表明tP4H确实参与了该非原生反应（图1-2）。
为提高tP4H对底物1的活性，作者进行了定向进化，由于酶稳定性差，表达和纯化变体困难，且野生型酶活性随时间下降。利用深度学习工具ProteinMPNN，重设计了tP4H序列，固定了关键活性位点和一些保守残基。最终生成了96个序列，其中69个能表达可检测量的蛋白，11个在天然底物上有可检测活性。表现最佳的突变体R2_11在L-Pip上的kcat接近野生型，同时热稳定性显著提高，尽管非天然底物的活性有所下降（图3）。
接下来作者通过定向进化提高了非原生羧酸C(sp³)-H羟化酶tP4H的活性，针对活性位点中的底物结合残基进行了三轮突变筛选，最终获得了H58L、H58L/W170Q和H58L/W170Q/E118K，TTN分别提高至7、15和31，整体提高了6倍。随后，对ProteinMPNN稳定突变体R2_11进行进化，筛选出H58F突变体，TTN相较于R2_11提高了27倍。进一步优化后，得到了L174G和V57H突变体，最终三重突变体TTN达138，整体提高了80倍，显示出稳定蛋白质框架显著促进了酶的可进化性（图4）。
R2_11三重突变体在稳定性方面优于野生型tP4H的三重突变体，且相比于R2_11母体，仅有轻微的热稳定性下降。更高的稳定性使得反应在更高温度和更短时间内进行更有效（图5）。R2_11三重突变体的稳定性表明，它更适合进一步的工程优化，未来的工作可集中在提高反应周转率、选择性和底物范围等关键指标上。
文章信息：Computational Stabilization of a Non-heme Iron Enzyme Enables Efficient Evolution of New Function
文章链接：https://doi.org/10.1002/anie.202414705
