甲壳素是一种关键的生物聚合物，存在于甲壳类动物的外骨骼和真菌的细胞壁中，是继纤维素之后自然界中第二大天然聚合物；N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）是甲壳素的基本组成单元，构成了其不溶性聚合物性质。全球每年生产约1000亿吨甲壳素，特别是在处理虾、蟹和龙虾的海鲜产业，每年约产生600到800万吨富含甲壳素的废物。如果这些废物得不到妥善处理，将会对环境造成严重危害。因此，研究开发针对不溶性甲壳素降解策略，对于资源回收利用及环境问题解决至关重要。传统的甲壳素降解方法通常需要苛刻的水解条件，并伴随有毒副产物的产生，带来了重大的环境和安全挑战。这些方法通常涉及使用刺激性化学品，导致产物质量低下，并产生危险废物。此外，常见的化学消化过程中使用的强酸会导致大量废水和有毒化学品的管理需求，从而加剧环境影响。相比之下，酶促水解提供了一种更环保且特异性强的降解方法。参与甲壳素降解的几丁质酶主要归类为GH18、GH19和GH20糖苷水解酶（GH）家族。其中，GH18家族的几丁质酶已经被广泛研究，其催化域具有典型的(β/α)8 TIM桶状结构，并包含一个保守的DxDxE基序。然而，由于目标糖苷键难以接近酶的活性位点，这些酶在降解高度结晶且溶解性差的甲壳素时，其催化效率相对较低。与表面积较大、结晶度较低的胶体甲壳素相比，不溶性的粉末状甲壳素保留了大部分结晶结构，使其对酶促降解的抵抗力显著增强。这种差异在工业规模生产几丁寡糖时形成了一个主要瓶颈，包括如rEF-Chi和Chisb在内的几种能够有效分解胶体甲壳素的酶，其在不溶性粉末状甲壳素底物上的水解能力受到限制。因此，提高几丁质酶对粉末状甲壳素底物的水解效率成为一个关键挑战，然而，目前缺乏专门解决这一特定挑战的研究。实现这一突破将释放甲壳素酶促降解的全部潜力，可持续和可扩展生产宝贵几丁寡糖生物分子。本研究专注于通过基因工程改造P. oxalicum来源的PoChi几丁质酶，旨在增强其对不溶性甲壳素的降解能力，成功开发了PoChi-ChBD、ChBD-PoChi和PoChi-FnIII-ChBD三种融合几丁质酶。研究结果显示，其中PoChi-FnIII-ChBD表现出最高的底物亲和力（Km = 2.7 mg/mL）和特异性活性（15.4 U/mg），超过了之前报道的几丁质酶，包括Exiguobacterium antarcticum DW2（1.8 U/mg）、Paenibacillus pasadenensis CS0611（0.5 U/mg）和Microbulbifer sp. BN3（0.1 U/mg）。热稳定性实验表明，所有融合几丁质酶相对于野生型PoChi均保持更高的相对活性，尤其是PoChi-FnIII-ChBD即使在较高温度下也能够保持显著的活性。此外，PoChi-FnIII-ChBD展示了广泛的pH适应性，即在pH范围4.5至7.5内保持超过80%的活性，突显其在多种应用场景中的潜力。所有融合几丁质酶在最佳pH条件下储存10天后，仍保持约90%的相对酶活性，显示出优异的储存稳定性。在最佳条件下使用甲壳素粉末作为底物进行的甲壳素结合能力和水解效率评估显示，ChBD结构域显著增强了酶对甲壳素底物的吸附能力。尽管FnIII结构域并不直接参与甲壳素的结合，但可能通过帮助ChBD结构域的正确定位，促进酶促水解反应并提高蛋白稳定性。与野生型PoChi相比，三种融合酶ChBD-PoChi、PoChi-ChBD和PoChi-FnIII-ChBD的水解效率分别提高了34%、51%和83%。特别值得注意的是，PoChi-FnIII-ChBD对不溶性甲壳素的水解能力超过了大多数几丁质酶对胶体甲壳素的水解能力。这一策略在增强不溶性甲壳素降解方面显示了该酶在工业生物技术中的巨大潜力，为可持续生产高价值的N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）及其他几丁寡糖提供了前景广阔的方法。![]()
图1. 不同条件下对几丁质酶活性进行表征。(A)不同缓冲体系的pH值对几丁质酶活性的影响。(B)不同pH条件下几丁质酶活性随天数变化（第0天、第5天和第10天）的稳定性。(C)温度对几丁质酶活性的影响。(D)不同温度下几丁质酶热的稳定性随时间变化图谱。(E) 5和10 mM金属离子浓度和EDTA对几丁质酶活性的影响。(F) 各种化学试剂对几丁质酶活性的影响。(G) 不同浓度的Triton X-100对几丁质酶活性的影响。![]()
图2. 几丁质酶酶解产物生成的时间过程分析。M：标准品；G1-G6：(GlcNAc)1-6。(A1-A3) 薄层色谱(TLC)分析0、3和6小时以及不同时间点的降解产物，其中G1-G6表示不同的产物。(B1-B3) 热图显示与A1-A3相同时间点的这些产物的相对丰度。(D) 高效液相色谱(HPLC)色谱图显示标准化合物和不同保留时间的反应产物。(E) 降解产物(GlcNAc, (GlcNAc)2, (GlcNAc)3, 和 (GlcNAc)4)的浓度和(F) 比例随时间的变化。![]()
图3. PoChi中芳香族残基突变体结构和功能表征。(A) PoChi结构的示意图。突出显示与底物结合和酶活性相关的关键氨基酸残基。(B) PoChi参与底物结合的芳香族残基的保守性分析。颜色深浅表示保守性水平，配体上数字表示糖结合位点。(C) 不同突变体在胶体甲壳素和甲壳素粉末上的相对酶活性。
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图4. 融合质粒构建和不同结合域的PoChi变体的功能表征。(A) pQE30-PoChi、pQE30-PoChi-FnIII-ChBD、pQE30-ChBD-PoChi和pQE30-PoChi-ChBD重组质粒的示意图以及载体大小。(B) 重组蛋白与甲壳素粉末的结合效率，以结合蛋白的百分比表示。(C) 重组蛋白相对于野生型PoChi的酶活性。(D) PoChi及其融合蛋白的温度依赖性活性曲线，归一化至其最大活性。(E) pH依赖性活性曲线，同样进行归一化。(F) PoChi及其融合蛋白的热稳定性和 (G) pH稳定性，相对于其峰值活性。该研究成果近期发表在Bioresource Technology杂志上，湖南农业大学食品科学技术学院硕士研究生陈晓为论文第一作者，夏菠副教授为通讯作者。
Enhanced degradation of insoluble chitin: Engineering high-efficiency chitinase fusion enzymes for sustainable applications
Xiao Chen, Li Pang, Wentao Yang, Hong Tian, Youjin Yi, Bo Xia⁎
Bioresource technol. 2024, 131401. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2024.131401
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作者介绍：
夏菠，湖南农业大学食品科学技术学院副教授，硕士生导师。2002年6月毕业于湖南农业大学食品科学技术学院，获学士学位；2012年6月获中南大学公共卫生学院博士学位，师从庄志雄教授；2004年4月至2008年6月，在湖南农业大学食品科技学院微生物系任助教。2008年7月至 2016年6月，在湖南农业大学食品科技学院微生物系任讲师；2013年6月至 2016年6月，在深圳市疾病预防控制中心/第一军医大学公共卫生与热带医学学院，广东省医学重点实验室从事博士后研究工作。2016年6月至今，在湖南农业大学食品科技学院微生物系担任副教授一职。获中华预防医学会科技二等奖、湖南省人民政府科技进步三等奖（2016年和2018年）和广东省人民政府科技进步二等奖。主要从事生物转化、结构引导性蛋白质工程等相关研究。在Bioresource Technol. 、Sci. Total Environ.、Biomed. J.、 Chemosphere、J. Food Biochem.等期刊发表第一或通讯作者SCI论文多篇；申请发明专利十余项，获授权5项；主持湖南省级项目2项。担任湖南省营养学会理事，中国毒理学会会员，广东省毒理学会会员。![]()
作者介绍：
陈晓，湖南农业大学食品科学技术学院2022级硕士研究生，研究方向为生物转化。以第一作者身份在国际Top期刊Bioresource Technology发表SCI论文一篇。
