酶是理想的化学合成支架，因其利用共价和非共价相互作用在反应中实现高选择性和独特的反应机制。尽管在天然酶功能中涌现机制较为常见，但在非自然反应中则较为罕见。未活化胺的烯烃氢氨化是一种经济有效的构建C–N键的策略，但在实际应用中面临许多挑战。过渡金属催化剂对构建立体位阻键效果不佳，且自由基中间体的反应往往仅形成反马克瓦尼科夫产物，难以实现不对称合成。因此，作者提出开发酶催化的分子内氢氨化，以制备2,2-二取代的吡咯烷。研究显示，黄素依赖的“ene”还原酶能催化多种C-C、N-C和C-O键形成反应，具有可调的选择性。本研究的目标是克服使用未活化自由基前体的挑战，以提高光酶促反应的合成效用（图1）。
作者首先探索了基于模型底物1的自由基环化反应，通过5-exo-trig或6-endo-trig环化形成产物。构建了一系列黄素酶，假设天然催化氧化转化的酶能更好地耐受活性位点生成的自由基。实验发现，多种酶（如单胺氧化酶、苯乙烯单氧化酶等）无法催化氢氨化反应，而来自Acinetobacter calcoaceticus的环己酮单氧化酶（cyclohexanone monooxygenase，AcCHMO）则以1%的产率生成5-exo-trig产物。为了提高活性，构建了CHMO同源酶的文库，通过位点饱和突变策略逐步提高反应的产率和不对称选择性。针对靠近辅因子的氨基酸进行突变，最终通过多轮突变（如R490E、I491T和A479H）获得了高达97%产率和95:5的选择性。分子动力学模拟显示，这些突变位点位于动态环区，有助于保持活性位点的开放性。我们在无细胞透析裂解液中测试了酶的催化效能，降低催化剂用量至0.04 mol%，仍能以17%的产率生成产物4，但未透析的裂解液中产物的选择性有所下降。我们发现NADP+可能是潜在抑制剂，其添加会降低产率和选择性，且高浓度的NADP+完全抑制反应。这与天然反应机制的要求不同（图2）。
最终酶AcHYAM（氢氨化酶）在多种底物上进行了环化催化测试。实验发现，各种取代的苯胺和苯乙烯在反应中表现良好，电子丰富的芳烃通常提供更高的产率和选择性。大型取代基（如萘）在苯胺侧和苯乙烯部分未降低产率，且具有优异的选择性。此外，电子缺乏的含氮杂环也能被耐受，克服了布朗斯特酸催化环化的限制。尽管某些情况下杂环取代对环化反应影响显著，蛋白工程有望解决这些问题。经过同源底物的6-exo-trig环化，获得了13%的产率和78:22的选择性。我们还应用该方法合成了三种含有芳基吡咯烷的药物活性成分的α-甲基化类似物。其中，TRK抑制剂GNF-862541的甲基化吡咯烷片段以85%的优良产率和94:6的选择性获得，改良的肌动蛋白抑制剂α-甲基拉罗替尼片段也得到了77%的产率和75:25的选择性。这些合成展示了该方法在制备通常需要多步反应的取代类似物方面的便利性（图3）。
基于对还原型黄素（FADhq*）的需求和缺乏能量转移机制的证据，我们认为FADhq*负责烯烃的自由基启动还原反应。尽管其电位不足以还原底物，活性位点的电正性能够降低所需电位并稳定生成的阴离子黄素半醌（FADsq–），从而快速形成苯基自由基。我们发现，苯胺与苯基自由基之间的相互作用可能改变系统的氧化还原特性，并且超共轭相互作用提高了单占分子轨道的能量，促使自由基易于氧化。通过密度泛函理论（DFT）计算，得到了预组织中间体的前沿分子轨道结构，显示出键合特性并支持了氧化还原激活的假设。此外，预对齐结构的氧化电位显著降低，这一特征对于从自由基生成苯基阳离子至关重要（图4）。
根据观察到的反应性和机制证据，作者得出结论，该酶通过一种不同于小分子催化的机制促进氢氨化反应。这种机制依赖于双中心三电子反键中间体的排斥相互作用，从而降低活性位点内自由基的氧化电位。分子动力学模拟表明，AcHYAM环境为模型底物提供了更多旋转自由度，并使其能够以适合C–N键形成的构象排列。尽管10-苯基苯噻嗪能将α-甲基苯乙烯还原为自由基阴离子，但没有模板化的条件下不会发生C–N键形成（图5）。
综上，作者开发了一种高度选择性的光酶，用于使用苯胺进行立体选择性的氢氨化反应。实验和计算表明，该反应利用了一种之前未知的C–N键形成机制，这种机制得益于蛋白质活性位点提供的预组织。C–N键形成的新兴机制突显了酶在应对化学合成中的反应性挑战时揭示新路径的潜力。
作者信息及链接：
Todd K. Hyster：https://hyster.princeton.edu
研究方向：1. 使用光酶催化解锁新的合成反应；2. 利用酶简化有机合成；3. 构建具有应急功能的人工酶。
文章信息：Emergence of a distinct mechanism of C–N bond formation in photoenzymes
文章链接：https://doi.org/10.1038/s41586-024-08138-w
