酶作为强效生物催化剂，能够高效且选择性地促进化学反应。通过基因组测序、定向进化和计算设计的发展，酶被发现并工程化，以满足活性药物成分和精细化学品的可持续生产需求。然而，与过渡金属催化和有机催化相比，酶催化的反应类型，尤其是碳-碳键形成反应，仍然有限。为了扩展酶的催化范围，研究人员通过将非天然氨基酸引入酶中，成功设计出能够催化非天然反应的人工酶。这一策略已被多项研究证明具有可行性，并进一步推动了酶在复杂化学转化中的应用。
为了设计一种以pBoF为催化基团的人工酶，作者选择了LmrR作为蛋白质支架。LmrR单体具有αβ结构，内部存在一个由色氨酸残基形成的疏水孔。通过分析LmrR的晶体结构，在α1和α4螺旋中选择了7个位置引入对硼基苯丙氨酸（p-boronophenylalanine，pBoF），并通过质谱验证了pBoF的成功嵌入。随后使用这些LmrR突变体催化Friedel-Crafts烷基化反应，结果显示，pBoF在α1螺旋上的变体表现出较高的产率和对映选择性，其中M8pBoF变体的产率最高，A11pBoF变体的对映选择性最佳。实验结果表明，pBoF对于催化活性至关重要，且催化过程依赖于硼酸基团的共价激活机制（图2）。
接下来，通过定向进化进一步优化了该人工酶的活性和对映选择性。尽管A11pBoF突变体显示了最高的对映选择性，但由于其与W96位置接近，可能限制了底物的适用范围。因此选择对M8pBoF变体进行进一步优化。首先，通过对结合口袋中的9个残基进行丙氨酸扫描，发现V15A、L18A、N88A和M89A变体有显著变化。随后，对L18、N88和A92进行饱和突变，筛选出几个表现最佳的变体，通过组合突变，获得了M8pBoF-N88A-A92G和M8pBoF-V15A-N88A突变体，表现出最高的产率和对映选择性。基于实验结果，推测通过突变减小结合口袋的空间，能够提升底物的定位，从而提高对映选择性。最终，M8pBoF-N88A-A92G-I4L变体实现了最高产率和对映选择性（图3）。
为了探究该人工酶催化的反应底物范围，首先在降低催化剂负载的情况下测试了1a和2的反应，产率（90±6%）和对映选择性（92:8 e.r.）略有下降。进一步研究了不同β位取代基的Michael受体，发现随着取代基体积增大，产率和对映选择性均下降。随后测试了芳环上不同取代基的影响，结果显示羟基邻位的电子吸引基团能提供优良的产率和较好的对映选择性，而电子供给基团则降低了产率但保持了良好的对映选择性。对于不同取代位置，取代基与活性位点侧链的相互作用会影响反应性和对映选择性（图4，图5）。
为了进行制备规模的合成，作者采用了全细胞催化技术。最初使用表达LmrR-BAGL变体的大肠杆菌冻干粉催化1a和2的反应，产率不足20%。通过优化共溶剂、底物比例和催化剂用量，发现异丙醇作为共溶剂效果最佳。最终，在50毫克规模下，产物3的收率达到96%，e.r.值为93:7；在150毫克规模下，化合物26的收率为99%，e.r.值为96:4，重结晶后e.r.值提升至>99:1，收率为85%（图6）。
为了探索这种生物催化Friedel−Crafts烷基化的合成应用，作者将其与过渡金属催化的吲哚去芳香化芳基化反应结合。Friedel−Crafts烷基化产物的三氟甲磺酸酯与Pd(0)物种发生氧化加成，随后吲哚环C-3位在碱的作用下进攻钯(II)中心，经过还原消除形成螺吲哚啉骨架。为了验证这一假设，将化合物3转化为三氟甲磺酸酯3-I，产率为76%。在优化催化剂、配体、碱和反应温度后，最终获得了产率90%、非对映立体选择性为20:1的目标产物。该方法对多种底物表现出良好的耐受性，产物具有高产率和优异的对映选择性（图7）。
基因编码扩展是一种引入新型化学反应至酶催化中的强大技术，之前的研究包括使用非天然氨基酸设计人工酶。本研究描述了通过基因编码对硼酚基苯丙氨酸生成能够催化不对称Michael型Friedel−Crafts烷基化反应的人工酶，其活性位点不仅能结合底物，还决定了对映选择性。优化后的酶对多种底物显示出高产率和优异的对映选择性，并开发了便捷的克级转化方法。此外，还展示了通过钯催化的去芳香化芳基化反应，成功实现了螺吲哚啉衍生物的合成。考虑到硼酸催化的多功能性，预期此方法可用于设计能够催化其他非生物反应的人工酶。
作者信息及链接：
项征：https://scbb.pkusz.edu.cn/info/1015/1008.htm
研究方向：1. 基因编码扩增及其在生物学研究中的应用；2. 生物催化和代谢工程来实现天然产物的半合成和多样性合成；3. 针对重要药物靶点的小分子抑制剂的研究
文章信息：Design and Evolution of an Artificial Friedel–Crafts Alkylation Enzyme Featuring an Organoboronic Acid Residue
文章链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c03795
