食管鳞状细胞癌（ESCC）具有高死亡率和不良预后的特点，主要治疗方法包括手术、化疗、免疫治疗和放疗，以及它们的联合治疗。然而，这些治疗难以区分正常细胞和恶性细胞，并且ESCC肿瘤内药物释放不一致，这些药物的疗效进一步降低。纳米给药系统（NDDS）具有增加药物溶解度，增强药物在肿瘤组织内的分布，最小化细胞毒性，穿越生物屏障的能力，以及联合药物应用的潜力。通过将NDDS附着在肿瘤特异性细胞表面受体（如适配体）上，可以放大药物递送的功效和特异性，这些修饰的NDDS靶向恶性细胞，同时保留健康细胞，从而提高治疗效果。
南京医科大学附属淮安第一医院王其龙教授团队为了抑制ESCC肿瘤，筛选出ESCC特异性DNA适配体，并构建一种独特的适配体修饰纳米系统，以靶向药物和基因递送（图1）。使用天然蛋黄脂质纳米载体(EA1-EYLNs-PTX/siEFNA1) 开发了EA1修饰的纳米系统，该载体同时负载紫杉醇 (PTX) 和Ephrin A1 (EFNA1) 的小干扰RNA，这种组合可以对抗食管鳞癌的增殖、迁移、侵袭和肺转移。
利用Cell-SELEX过程进行筛选，基于拷贝数和家族分布的前5个序列EA1、EA2、EA3、EA4和EA5被列入与KYSE-150细胞结合分析的潜在适体候选序列。通过共聚焦图像及流式细胞分析术等，分析表现更好的EA1和EA2，发现它们具有优异的亲和力、特异性和组织靶向能力，且EA1要优于EA2。因此，选择EA1进行后续实验。
接着，合成了Cy5.5-EA1和Cy5.5-EA5（作为对照适体）修饰的EYLNs，后建立异种移植皮下和肺转移小鼠模型。给小鼠静脉注射EYLNs-Cy5.5-EA1和EYLNs-Cy5.5EA5，EA1和EA5都能将EYLN传递到肿瘤组织。与EYLNs-Cy5.5-EA5对照组相比，EYLNs-Cy5.5-EA1组肿瘤部位的荧光强度明显更高，并且器官和肿瘤荧光强度存在显著差异，同时在肺转移小鼠模型中表现出了优异的靶向肺转移的能力。这些发现强化了这样一种观点，即引入EA1可以显著促进ESCC肿瘤中EYLNs的靶向递送和积累，从而优化纳米药物在体内的递送。
通过分析它们的形态、大小分布、𝜁电位和包封效果，说明带负电荷的ssDNA适配体成功地附着在EA1-EYLNs-PTX/siEFNA1的表面，包封效率为92.7±2.41%。为了评估EA1-EYLNs-PTX/siEFNA1在体内的核酸酶抗性，采用含有10%胎牛血清和RNase缓冲液的DMEM培养基模拟血液稳定性。结果表明，附着在脂质体上的核酸（无论是siRNA还是ssDNA）具有更好的抗核酸酶降解的弹性。同时，EA1-EYLNs-PTX/siEFNA1在中性pH下保持其结构并表现出稳定的药物释放，但当pH从7.4降至5.5（模拟肿瘤环境）时表现出明显的释放。
随后检测了EA1修饰的PTX/ siefna1负载纳米药物在KYSE-150细胞中的药物分布，以确定EA1修饰是否增强了结合和摄取。通过共聚焦图像可以看出，修饰适配体的载体在细胞内的积累增强，并且其可以通过内溶酶体途径进入和脱离溶酶体膜，促进siEFNA1和PTX在细胞质中的积累，这是其他NDDS无法做到的。为了复制ESCC的病理渗透屏障，在体外构建了KYSE-150细胞的三维肿瘤球体。然后用cy5标记的EYLNs处理KYSE-150-3D肿瘤球体12小时，以测量穿透能力。结果表明，EA1显著增强了ESCC深层球体内EYLN-PTX/siEFNA1的分布，说明EA1-EYLN-PTX/siEFNA1可以提高体内实体瘤的穿透能力。
图5 EA1修饰的PTX/ siEFNA1负载纳米药物的细胞内摄取、内吞作用、内体逃逸和肿瘤渗透
通过Western blotting、实时细胞分析（RTCA）、流式细胞术和Transwell实验，评估ea1修饰的PTX/ siefna1负载纳米药物对KYSE-150细胞的体外抑制效果。通过EA1修饰增强siEFNA1的高效递送，可显著降低ESCC细胞中EFNA1的表达（图6a，b）。此外，将KYSE-150细胞暴露于各种纳米药物和PTX表明，siEFNA1递送增强了PTX抑制KYSE-150细胞增殖、迁移、侵袭和提高凋亡水平的能力。EA1修饰的效果更加明显（图6c-f）。这表明EA1可以提高纳米药物的结合效率，从而具有更强的杀肿瘤作用。
