微塑料指直径小于5 mm的塑料颗粒,是重要污染载体,因其体积小、比表面积大,吸附污染物能力强,已成全球关注的生态系统污染物。某团队分离出聚氯乙烯(PVC)和聚苯乙烯(PS)的DNA适配体,其含约90%胞嘧啶与胸腺嘧啶,嘌呤仅10%,其中 PVC-1适配体与PVC结合力为随机测序 DNA的6倍,在测试塑料材料里,PVC和PS比结合力最高,用荧光团标记的PVC-1适配体可检测低至1 mg的PS/PVC微塑料,分子动力学模拟显示适配体为吸附会尽量与塑料表面接触。
原理见图1,鉴于微塑料尺寸大且会沉淀于试管底部,DNA适配体选择是将微塑料与含约3×10¹²随机DNA序列文库共同孵育,该文库含30个核苷酸(N30)的随机区,两侧为固定区,用于引物结合与PCR扩增。用缓冲液冲掉未结合DNA链,加0.004%Tween 80收集残留在微塑料上的DNA序列,再经PCR扩增,为下一轮筛选提供种子。
首先,按照以上原理,对PVC适配体进行10轮筛选,并对最后一轮的文库进行测序。可以发现最丰富的序列都富含嘧啶。通过Mfold预测,PVC-1适配体的二级结构是一个简单的发夹,带有一个富含胞嘧啶的环(图2)。事实上,所有排名前10位的序列都具有相同的大循环结构。作者推断,这种PVC结合适配体通过最大化与PVC表面相互作用的核苷酸数量而在SELEX过程中存活下来。考虑到这些序列的相似性,作者选择了最丰富的序列PVC-1进行进一步的研究。
为了表征PVC与适配体的结合,作者将100 nM荧光标记的PVC-1适配体与5 mg PVC微塑料孵育。用缓冲液洗涤去除未吸附的DNA后,在上清液中加入Tween80使剩余的吸附DNA完全释放,产生荧光信号如图3A所示。作者测试了与适配体长度和总体二级结构相同的荧光标记的随机DNA序列(rDNA1)进行比较,发现PVC-1适配体与PVC的结合比rDNA1高6倍,表明适配体与PVC的结合具有特异性。然后测试了基于PVC-1适配体的两个突变体(命名为mut1和mut2),突变体和PVC-1与PVC微塑料的结合相似(图3)。进一步测试了三种DNA均聚物(A30、T30和C30),结合顺序为T30≥C30>>A30。poly-T和poly-C的高结合证实了这两种碱基对适配体与PVC结合的重要作用。之后,将不同浓度的PVC-1适配体与5mg的PVC微塑料孵育,以获得结合等温线(图3C)。数据与Langmuir等温线吻合良好,表明适配体在聚氯乙烯微塑料上的吸附为单层可逆吸附。利用Langmuir模型,计算结果显示出PVC-1适配体的结合比rDNA1更紧密。
接着,作者评估了PVC-1适配体与PVC结合的选择性。将该适配体与其他常见塑料材料孵育,PVC-1适配体显示出与PVC和PS类似的结合。为了直接比较其结合亲和性,添加了与适配体长度相同的非标记随机DNA (rDNA2)与PVC-1适配体竞争吸附,较低的适配体位移意味着较高的结合亲和力。PET和PETG的适体位移最小,其次是PVC和PS。适配体从其他塑料材料中位移超过50%,表明它们对PVC-1的亲和力较低。随后使用荧光标记的rDNA1测试了与PVC、PS、PP、PC和PET的非特异性结合。相比之下,rDNA1在PVC和PS上的非特异性吸附明显低于与适配体的结合。然后我们减去rDNA1的荧光响应(即非特异性相互作用),对PVC的选择性变得更加明显,如蓝条所示(图4)。
由于PVC的适配体也表现出与PS的结合亲和性,因此以PS微塑料为靶标进行了另一次适配体选择实验。经过十轮筛选,前两个富集序列与PVC富集序列相同,获得PVC-1适配体在PS上的结合等温线,并拟合到Langmuir等温线上,结果与PVC相似。由于PS和PVC的结构不同,作者推断PVC-1可能通过范德华力与这两种微塑料结合。
然后,作者利用分子动力学模拟适配体结合。能量分析显示,适配体与PVC之间的相互作用主要由范德华力驱动。对0 ns(I)、10 ns(II)、20 ns(III)和100 ns(IV)的结构快照进行了分析,表明适配体与PVC之间的初始接触发生在0-10ns期间,在整个冷却过程中保持稳定的粘附到80-100 ns。碱基群12-13、20-24、33-34的接触点均位于环路区域(图5)。PS上的吸附过程也呈现出类似的趋势。表明适配体在PS或PVC上的选择性吸附主要归因于环区的柔韧性。
最后,考虑到PVC-1适配体与PS和PVC的选择性结合,作者研究了使用该适配体检测微塑料的方法。当PVC或PS浓度增加时,荧光信号增加,每种微塑料低至1 mg时就会产生明显的荧光。利用3σ/斜率方程(其中σ为不存在微塑料时背景变化的标准差)计算出PVC和PS的检出限分别为0.5 mg和0.6 mg。随后,使用光学显微镜评估微塑料的检测,PVC微塑料显示出强烈的荧光对比,而PE微塑料显示出可忽略的荧光信号(图6)。