细胞内RNA和蛋白质的凝聚现象在细胞功能中起着至关重要的作用。膜无结构的细胞器（如核仁、Cajal小体和应激颗粒）通过共定位核酸、酶和代谢物来调节生物合成、转录及其后续修饰和降解。近年来，研究者们发现，能够设计和表达具有特定性质的“设计师凝聚体”将对编程细胞行为和合成细胞工程具有重要价值。然而，现有的基于肽或天然RNA重复序列的策略在可编程性和蛋白质工程方面存在一定的局限性。
该研究的意义在于提出了一种模块化平台，通过合成RNA纳米结构的共转录表达，系统性地构建可编程的RNA凝聚体。这种方法不仅能够在合成细胞中生成膜无细胞器，还能够控制其数量、相对大小和形态，进而模拟自然膜无细胞器的功能。通过引入选择性结合蛋白的RNA适配体，研究者们能够实现对小分子和蛋白质的选择性捕获。这一研究为合成生物学和合成细胞科学提供了新的工具，可能在细胞功能的空间组织和调控方面开辟新的方向，具有广泛的应用潜力。
四臂纳米星由一条单链RNA链组成，该链可共转录折叠成预期的星形形状，其灵感来自于已充分表征的DNA纳米星（图1a）。RNA基序通过每个臂末端存在的自互补HIV型接吻环 (KL) 相互作用，而不是通过DNA设计中采用的单链 (ss) 突出端或疏水修饰。类似的KL已被证明可以促进细菌核糖开关的缩合。我们测试了三种RNA纳米星设计，标记为A、B和C，具有相互正交的KL序列（图1a）。在设计A和B中，双链RNA (dsRNA) 臂之一包括荧光发光适体 (FLAP)：孔雀石绿适体(MGA)和西兰花适体(BrA)（图 1a）。图1b中显示所有三种设计在体外转录时均形成聚集体。变体A和B形成凝结物，凝结物成核并生长，并伴有频繁的聚结事件，表明其处于液态。相反，设计C形成了一种凝胶状渗透结构，无法产生离散的冷凝物，但仍随着时间的推移而增长。与A和B相比，设计C的表观粘度较高，这与材料的熔化温度相关，其中C最高，其次是B和A（图1c）。所有聚集体均显示出预期的荧光输出，即A（红色）的MGA通道、B（青色）的BrA通道以及C（白色）的两个通道。
KL正交性使得A和B设计能够同时转录，很容易形成不同的共存缩合物（图2a），证实了碱基配对无关缩合的影响可以忽略不计。如果其中一个 RNA 基序变得非粘性，则一种物质的凝聚物与另一种物质的分散RNA纳米星共存（图2b）。A和B冷凝物的相对大小可以通过调整相应DNA模板（[A-T]和[B-T]）浓度之间的比率来控制。通过时间相关的μCLD分析（图 2c）以及最终冷凝半径rc的分布，直观地展示了相对尺寸控制（图2a；图 2d）。
可定位的RNA凝聚物对于设计合成细胞或活细胞的区室化非常有价值，它们可以作为MLO发挥作用，能够招募化合物并支持功能的空间分离。为了证明这一点，作者在由油包水（W/O）液滴构建的合成细胞内转录了冷凝物（图3a）。所有设计均在每个合成单元中形成单个球形冷凝物（图3b），包括仅批量生成扩展网络的设计C。通过注意到C聚集体需要在合成细胞内更小的长度尺度上松弛，可以合理地解释不同的形态。然而，与A和B相比，C的形状松弛速度较慢（图3c）。冷凝物尺寸的多分散性反映了合成细胞尺寸的变化，冷凝物的最终体积与封闭的W/O液滴的体积成线性比例（图3d）。具有两种不同A和B MLO的合成细胞 在大多数情况下，每个合成细胞都含有每种类型的一种冷凝物（图3g），可以通过改变模板比来控制细胞器的相对大小（图3f）。当包括组分C时，得到了三个不同的阶段，说明了扩大细胞器数量的可能性。
前文展示了RNA凝聚体可以选择性地捕获小分子荧光染料，但模拟天然MLOs需要捕获更大的功能性大分子，特别是蛋白质。为了捕获蛋白质，设计A和B被修改以包含5'悬垂，通过碱基配对连接蛋白质结合RNA适配体（aptamer）。设计了AYFP和BSTV纳米结构，分别连接到黄色荧光蛋白（YFP）结合适配体和链霉亲和素（STV）结合适配体（图4a）。在合成细胞中共同表达修改后的纳米星和它们的伙伴适配体，导致目标蛋白质（增强型黄色荧光蛋白EYFP和Alexa Fluor 405链霉亲和素Alexa405-STV偶联物）在形成的MLOs中容易分配（图4b）。通过参数ξ量化蛋白质分配，计算为蛋白质在MLOs内外的荧光强度比（图4c）。在没有适配体的情况下，目标蛋白质留在合成细胞的腔内，反分配现象可能是由于RNA和蛋白质之间的排除体积相互作用。
本文通过设计和合成可编程的RNA纳米星，探索了RNA凝聚体在合成细胞中的应用潜力。研究表明，利用共转录技术可以有效地生成具有特定功能的RNA凝聚体，这为合成生物学的发展提供了新的思路和方法。通过调控RNA纳米星的设计和转录条件，研究者能够实现对凝聚体性质的精确控制，从而在未来的生物工程和合成细胞研究中发挥重要作用。
