水蛭素是一种从水蛭提取的多肽，能同时抑制凝血酶的外显位点和活性位点，具有显著的抗凝血和抗血栓效果，广泛应用于心脑血管疾病的临床治疗和预防。受此启发，费城儿童医院研究所的Sriram Krishnaswamy博士和杜克大学的Bruce A. Sullenger教授的科研团队通过将结合外显位点的适配体与结合活性位点的小分子抑制剂连接起来，设计了几种针对凝血酶和Xa凝血因子的EXosite-ACTive位点（EXACT）抑制剂。
EXACT抑制剂（合成原理如图1a所示）结合了DNA适配体HD22和达比加群（DAB），前者与凝血酶的ABE2位点结合，后者与活性位点结合。通过一个约49 Å长的多聚脱氧腺苷接头连接，促进两者同时作用。DAB的羧基与接头的氨基修饰剂偶联，形成的抑制剂命名为HD22-7A-DAB。
HD22-7A-DAB通过活性位点（洋红色）和外显位点（绿色）与凝血酶结合（图1b），通过灰色连接子实现协同作用，有效抑制凝血酶活性。HD22-7A-DAB的IC50为0.1 nM，显示出比DAB高500倍的凝血酶抑制效力，且在1 nM浓度下能抑制99%的凝血酶活性，这种效果归功于HD22和DAB的协同作用。EXACT抑制剂的增强效力可通过两步热力学模型解释（图1d）：首先，适配体或小分子与蛋白酶结合，将另一部分引导至附近，促进协同结合。第二步是单分子过程，与抑制剂浓度无关，即使在低浓度下也有效。作者通过BLI验证了这一模型（图1e）。
根据图1e所示的两步绑定模型，第二步的无单位解离常数KEA,I决定EXACT抑制剂的结合协同作用。假设链接结构域调节EXACT抑制剂的KEA,I影响EXACT抑制剂的效力，并且可以通过改变其接头长度来微调 EXACT抑制剂的效力。
接下来，作者合成了不同接头长度的HD22-DAB偶联物，并测试了它们的抗凝血酶效力。结果显示，随着接头长度增加，KEA,I降低，IC50减少，最大抑制增加，表明抑制效力提高。当接头长度为7 nt时，偶联物能完全抑制凝血酶，IC50为0.10 nM，显示出明显的抑制效果(图2a-f）。
作者研究了外显位点结合适配体对小分子抑制剂效力和选择性的影响，发现改变适配体结构域能重定向小分子抑制剂的选择性。用凝血酶适配体HD22替代Xa适配体后，EXACT抑制剂对凝血酶的特异性增强（图2g-i）。此外，基于适配体的抑制剂可被互补解毒剂AO逆转，发现AO2能使HD22-7A-DAB的抗凝效力降低超万倍（图2j-k）。
然后，探究了EXACT抑制剂HD22-7A-DAB对凝血酶活性的影响，发现其能完全抑制凝血酶对纤维蛋白原的裂解，且解毒剂AO2能迅速逆转这种抑制。此外，HD22-7A-DAB也显著抑制了凝血酶介导的FVIII激活（图3c-e），显示出比单独使用DAB和HD22更高的效力。
最后，验证HD22-7A-DAB在人血浆中的抗凝效果，发现其能显著延长凝血酶时间（TT），并在31 nM时使TT超过999秒。解毒剂AO2能在5分钟内基本逆转这种抗凝效果（图4a）。HD22-7A-DAB在500 nM浓度下对凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（aPTT）的影响也明显大于DAB，且这种影响可被AO2逆转（图4b-c）。在全人血中，HD22-7A-DAB能显著延长激活凝血时间（ACT），效果优于标准浓度的普通肝素。
