新生血管性眼部疾病（NOD）是全球视力障碍的主要原因。尽管针对血管内皮生长因子（VEGF）的抗血管生成疗法取得了重大进展，但仍然存在持续的挑战。在此，团队制备了溶酶体靶向嵌合体（称为VED-LYTAC）用于靶向降解VEGF，并通过NOD小鼠模型测试了嵌合体对病理性视网膜新生血管和血管渗漏的潜在治疗效果。VED-LYTAC由三个不同的模块构成：包含M6PR适配体的甘露糖-6-磷酸受体（M6PR）结合基序、靶向VEGF适配体的VEGF结合模块和稳定双适体结构所必需的接头，具有作为治疗NOD的治疗剂的潜力。
图1 VED-LYTAC的表征
团队首先选择了对M6PR具有高亲和力的40bp的DNA适配体，其次选用了三个具有不同长度的DNA序列，分别为VEGF-A、VEGF-A2、VEGF-A3以靶向VEGF，通过设计两种不同长度的linker，退火得到了6中不同结构的VED-LYTAC，构建示意图如图A所示。图B、C是其聚丙烯酰胺凝胶分析示意图。图D-G是其在0%胎牛血清的细胞培养基的稳定性分析，结果显示，23bplinker具有更长的半衰期。由于VED-LYTAC的稳定性对降解效率至关重要，因此，选用V4、V5和V6 进一步分析。图H-I是利用MST对VED-LYTAC与VEGF或M6PR蛋白结合亲和力的测定，结果显示V5具有更强的亲和力。图J到M是通过下拉试验对VED-LYTAC与VEGF和M6PR蛋白之间的相互作用的测定。
图2 VED-LYTAC通过自噬-溶酶体系统介导VEGF降解
为了研究VED-LYTACs降低VEGF水平的潜力，团队开展了ELISA实验，分析VED-LYTACs处理对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分泌VEGF的影响（图2A-2C）。结果显示（图2B和2C），V5处理显著降低了VEGF水平，并呈现剂量依赖性趋势。为进一步评估V5对VEGF降解的特异性，团队分别用VEGF-A2、M6PR-A和V5处理HUVEC，分析它们对VEGF水平的影响。结果表明，仅V5能有效降解VEGF，而VEGF-A2和M6PR-A这两个单一适配体则无此效果。此外，通过研究V5和单一适配体在细胞内的定位，我们发现V5和M6PR-A（但非VEGF-A2）均能够高效内化至溶酶体（图2D）。进一步的荧光显微镜观察显示，VEGF和M6PR与溶酶体内的V5共定位（图2E）。图2F和2G显示，当M6PR被耗竭时，V5降解VEGF的能力受到显著削弱，这表明V5是通过依赖M6PR的内化途径将VEGF靶向溶酶体降解。进一步分析（图2H）显示，在不同抑制剂处理条件下，自噬-溶酶体系统参与了VED-LYTAC介导的VEGF降解。这些结果表明，VED-LYTAC能够选择性地将VEGF靶向溶酶体进行内化和降解。
图3 VED-LYTAC在体外和离体均可抑制VEGF依赖性血管生成作用
由于VEGF在血管生成中起重要作用，且V5能有效降解VEGF，团队进一步进行了体外血管生成实验，以研究V5对内皮细胞血管生成能力的影响。结果表明，V5显著降低了HUVEC的迁移速度，延缓了伤口闭合（图3A-3C），并抑制了内皮细胞的管状结构形成（图3D-3F）。在胶原基质中，V5处理组还显著抑制了HUVEC的发芽能力（图3G-I）。此外，小鼠主动脉环试验显示V5可显著抑制血管网络的形成，进一步证实其抗血管生成作用（图3J-3L）。补充材料表明V5的有效性可能与其多功能结构相关。
图4 VED-LYTAC可抑制小鼠VEGF诱导的视网膜新生血管和血管渗漏
在进行体内实验前，团队首先评估了V5的生物相容性，证实其具有良好的生物安全性。之后，团队系统性研究了V5在减轻病理性血管生成方面的治疗潜力。研究表明，V5可进入视网膜血管系统并保持稳定性和降解活性（图4A-B），显著抑制VEGF驱动的新生血管形成（图4D），减轻VEGF引起的血管渗漏并恢复紧密连接完整性（图4E-F）。此外，ERG结果显示V5可改善VEGF过表达模型中视网膜功能障碍（图4G-I）。总之，V5在治疗病理性血管生成相关眼部疾病中的具有较大的潜力。
图5 VED-LYTAC在OIR小鼠模型中表现出抗血管生成作用
基于V5在抗血管生成中的功效，我们进一步研究其在小鼠氧诱导视网膜病变(OIR)模型中的治疗潜力。OIR小鼠的VEGF水平在缺氧阶段显著升高，导致病理性血管增生。V5治疗可有效降低VEGF水平，抑制异常血管形成，并减少红细胞渗漏，表明其可通过增强血管完整性和修复内皮细胞连接破坏来改善缺氧诱导的血管渗漏（图5A-5F）。此外，图5G-5I显示V5治疗显著恢复OIR小鼠的视网膜功能。总体而言，V5在OIR模型中展现出良好的治疗潜力，有望成为治疗病理性血管生成相关视网膜疾病的干预手段。
图6 VED-LYTAC可改善DR小鼠模型中的病理性视网膜新生血管和血管渗漏
受V5在OIR模型中抗新生血管作用的启发，我们进一步评估其在糖尿病视网膜病变(DR)模型中的疗效。STZ诱导的DR小鼠实验显示，V5治疗可显著降低VEGF水平，抑制无细胞毛细血管形成，缓解内皮细胞连接异常及血管渗漏（图6A-F）。V5显著改善了糖尿病小鼠的视网膜功能障碍（图6G-I）。这些结果表明，V5在恢复视网膜功能、血视网膜屏障完整性及血管正常化方面具有潜在应用价值。
图7 VED-LYTAC在缓解与DR相关的血管病变方面优于贝伐单抗
