在生物样本上对核酸进行直接原位成像是及时识别并控制病原体传播的重要手段，在公共卫生筛查、植物健康监测和食品安全监测等领域发挥了重要作用。然而，由于传统酶促扩增的液相反应环境流动性强，无法提供空间信息，造成分析结果无法与其样本分布对应。通常采用的甲醛固定等前处理，费时费力，影响成像分析效率。基于此，浙江大学林星宇研究员及其团队，受细胞基质启发，利用PEG作为原材料构建了仿生3D纳米限域水凝胶，通过粘附在生物样本表面起到限制核酸扩散的作用，为水凝胶原位限域界面扩增（In situ space-confined interfacial amplification，iSCIA）提供了固定空间，并结合人工智能深度学习模型对输出的荧光结果进行高分辨自动读取，实现了不同生物样本界面上多类别目标分析物的原位成像分析（图1）。
研究首先将两种PEG单体经室温下2 min的迈克尔加成反应快速形成PEG水凝胶。该材料具有可弯曲、可拉伸、易粘附及揭去后无残留的物理特性，同时透光率近100%，表明该材料适用于生物成像（图2a-d）。随后，验证了装载LAMP反应体系的PEG水凝胶对随机分布在玻璃和粗糙PDMS界面上的SARS-CoV-2进行原位成像的能力。结果表明水凝胶能够贴合不同界面并限制表面核酸的运动，通过原位界面扩增，使目标核酸在20 min内被点亮，呈现明亮荧光点，并直接反应了目标的分布情况（图2e、g）。此外，调控水凝胶浓度和扩增反应时间可以实现荧光点直径在15-300 µm范围内的变化，为不同尺寸样品表面和不同成像分辨率要求提供了高适配性。
研究采用光漂白实验，通过与荧光快速恢复的液相环境对比，验证了PEG水凝胶具有限制生物样本表面核酸扩散的能力（图3a-b）。同时，探究了限制能力与核酸链长度、单双链形式以及水凝胶孔径的关系。通过荧光恢复动力学曲线确定了不同条件下纳米限域环境的扩散系数和限制因子，表明核酸链越长，在孔径越小的交联水凝胶网络中受限程度越大。此外，核酸双链可能因其刚性结构，相较于单链核酸的受限程度更大（图3c-d）。进一步，通过对比水凝胶限域原位扩增前后图案化核酸和荧光染料标记单菌落的位置和荧光信号强弱，以及模拟“咖啡环”对DNA、RNA液滴蒸发后的印记进行荧光成像，同时证明其具有定位目标核酸的能力（图3e-g）。
为了使用水凝胶iSCIA实现不同目标的多路原位成像，研究在LAMP扩增中通过未掺入扩增信号报告子的淬灭实现了同时空间定位成像大肠杆菌和李斯特菌（图4a）。此外，训练了深度学习辅助的YOLOv8m模型，准确、自动分辨多重阳性荧光信号，具有良好精度和召回能力。同时，与常规ImageJ图像处理软件对比，AI模型识别效率更高，极大地避免了信号重叠、气泡、背景杂质引起的假阳性、假阴性结果（图4b-e）。
该研究开发的水凝胶iSCIA成功应用于多种材料界面上SARS-CoV-2的精准原位成像，包括玻璃，聚合物（PDMS、聚丙烯、聚碳酸酯和聚乙烯吡咯烷酮）和金属（Au、Al和钢），证明了其具有良好的可重复性（图5a-c）。在验证过程中，发现不同材料表面形成的扩增子荧光点形态不同。例如，聚合物界面上产生的荧光点是半球形，而在金属铝和钢表面则是半椭圆。经分析，荧光点的形态取决于纳米限域扩增和核酸受限扩散两个过程。采用COMSOL仿真模拟对扩增子荧光点形态进行了有限元分析，结果表明随着核酸与材料界面的亲和性增加，光斑形态由各向同性扩散（半圆）转变为各向异性扩散（半椭圆）（图5d）。
将开发的水凝胶系统首次用于植物病原体的现场检测。PEG水凝胶与植物叶片表面紧密共形接触，揭下后可观察到水凝胶上明显的叶片纹理。同时，通过在水凝胶中预埋SYBR GREEN染料，实现对叶片上链格孢菌感染情况的原位成像，与背景区分明显，具有高分辨率，并通过荧光共定位明确了链格孢菌的分布情况（图6a-d）。此外，还将水凝胶成像系统应用于监测鲜切生菜和梨表面大肠杆菌的分布与生长情况。随着切割后放置时间的延长，大肠杆菌从切割位置逐渐扩散至周围表面，数量迅速增加（图6e-f）。因此，该成像系统可应用于冷链水果和环境样本的原位成像分析中。
