核酸检测用于疾病诊断，如传染病、癌症、遗传疾病和线粒体疾病，目前的检测方法主要依赖于扩增和荧光技术。然而，结合扩增程序的方法耗时且容易因扩增子污染而获得假阳性结果。人类基因组的单核苷酸变异(SNV)对基因表达、RNA剪接和蛋白质识别具有广泛的影响。单分子操作平台是一种新兴的蛋白质和核酸检测策略，虽然在理论上提供了单个分子精度下的终极灵敏度，但由于扩散限制了目标与单分子探针的结合，在没有扩增的情况下检测限(LOD)仅为100 pM左右。为了解决这一限制，作者开发了一种称为THREF(杂交诱导串联DNA发夹重折叠失败)的检测方法，通过将多路磁镊子与可重复使用的平行统一串联DNA发夹探针相结合，用于高灵敏度、SNV识别、多路、无扩增、无荧光的核酸序列检测。
通过原位同步RCA生成了统一的串联DNA发夹探针(图1)。每个环状ssDNA模板包含四个功能元件：引物结合位点、腺嘌呤排除位点、腺嘌呤位点以及序列特异性区域(图1A)。通过同步RCA原位生成统一的串联DNA发夹探针(图1B)。每个探针的一端锚定至功能化玻璃表面，另一端连接至链霉亲和素功能化的磁珠，通过一对NdFeB磁铁对探针施加恒定的力，使用多路磁镊子实时监测探针的端到端距离(图1C)。如图1D所示可以成功地平行操作多个长度相似的探针(红色方块)。通过测量探针在12 pN下的总延伸(图1E)，确定探针在扩增15 min后的聚合数(n)为1470±154个重复。
THREF的一个优点是探针可重复使用，以检测一系列不同的样品。当循环至力Fr时，所有结合的靶标均解离，探针恢复到初始的关闭状态。通过持续11 h，重复2000个力循环，证明了串联发夹探针的稳定性和可重用性。在图2A、B中，使用了20 nt靶标。接下来通过改变靶标长度从12 nt到28 nt来评估序列特异性区域长度对检测灵敏度的影响(图2C)。发现灵敏度随着目标长度达到20 nt而提高，然后在更长的长度下下降。然而，过长的靶标(Oligo 28)可能会形成二级结构，并阻碍靶标与探针的杂交(图2D)。
选择了20个nt靶点，用单探针测试THREF的灵敏度。当目标物浓度从1 fM增加到100 pM时，作者在0.3、3和30 min(图3A、B)的不同tB时间进行灵敏度测试，得到的LOD分别约为321、57和5.5 fM(图3C)。此外，图3D显示LOD与靶标tB之间存在完美的线性关系(R2=0.986)，表明THREF在进一步延长tB(图3D中虚线表示)后具有单分子检测的潜力。
研究选择miR-122作为靶标，使用THREF检测其在肝细胞癌(HCC)灶组织中的表达水平变化。在检测过程中，两种平行操纵探针类型的典型时间延伸轨迹如图4B所示，来自六个探针的LB被绘制为图4C中的柱状图。以RNA-Ref为参照，分别计算了两例患者HCC灶和癌旁组织中miR-122的相对表达量(图4D)。随后将这些比率与癌旁组织的平均比率进行归一化，从而提供了miR-122的相对表达(图4D)。在这两例患者中，发现miR-122在HCC灶组织中下调，这与RT-qPCR结果(图4E)一致，且将测试时间从超过3小时缩短到仅10分钟。
接下来，通过检测16 nt正确靶标或具有SNV的突变靶标(v9C)来评估THREF的SNV识别能力。如图5B所示，在Ft为11.5 pN时，正确目标(紫色)的LB环中将Ft从11.5降低到10.5和8.7 pN(图5C, D)。Ft的调整导致突变靶点的探针完全折叠，而正确靶点的探针保持未折叠状态。因此，可以选择一个优化的Ft来区分保持稳定，而突变目标(一个SNV(橄榄色))由于不稳定的堵塞而逐渐缩短。为正确的和突变的靶标，而不需要重新设计或重建探针。
为了利用THREF对四种相似的miRNAs（let-7a, let-7b, let-7c和let-7d，它们只有一个或两个核苷酸不同）进行区分，作者将突变主要所在的3个-末端附近的16个核苷酸序列整合到SNV特异性区域，生成了一组名为p let-7的特异性探针(p let-7a、p let-7b、p let-7c和p let-7d)，如图6A所示。此外，还比较了THREF检测DNA和RNA靶标的效率，如图6B-E所示(使用100 pM靶标和10秒的tB)，当Ft在5.0-7.0pN范围内时，p let-7的每个探针都能有效地从大于或小于30 nm的阻断长度(虚线)所表示的突变靶标中区分出正确的靶标，从而能够区分出这些成员。
