外泌体是由细胞分泌的纳米囊泡，在多种病理过程中扮演关键角色，因其在肿瘤形成过程中的丰富分泌，被视为潜在的肿瘤生物标志物。传统外泌体富集和检测方法（如超速离心和聚合物沉淀法）存在的局限性，这些方法耗时长、专业技术要求高，并且常常导致外泌体纯度低，还可能损害外泌体结构与功能。2024年7月，吉林大学刑述教授团队与王晓峰教授团队提出了一种使用CD63适配体功能化Ti3C2的复合材料，设计了一种可同时富集和检测外泌体的生物传感器。
研究人员先利用酸处理法从Ti3AlC2制备出二维材料Ti3C2，并通过水热法合成Fe3O4纳米粒子以赋予磁性。随后，这些材料与聚乙烯亚胺（PEI）结合，增强其稳定性和生物相容性。通过3,3'-二硫代二丙酸二（N-羟基丁二酸亚胺酯）（DSP）将CD63适配体固定到材料上，实现特异性识别外泌体。最后，引入荧光标记的单链DNA（FAM-ssDNA），完成传感器的搭建（图1a）。在富集过程中，外泌体表面的CD63蛋白能够与CD63适配体特异性结合，从而使外泌体吸附在材料表面。吸附有外泌体的材料随后可以通过磁分离进行分离，通过加入二硫苏糖醇（DTT），可以裂解DSP中的二硫键，从而释放捕获的外泌体。对材料进行进一步的磁分离能够得到富含外泌体的样本（图1b）。其检测原理是当用FAM-ssDNA与CD63适配体结合时，其荧光会通过荧光共振能量转移（FRET）被Ti3C2淬灭。由于CD63适配体与外泌体之间具有更高的结合亲和力，当外泌体与适配体结合时，FAM-ssDNA会从Ti3C2表面释放，原本被Ti3C2淬灭的荧光得以恢复。通过测量恢复的荧光强度，可以在对外泌体进行定量检测（图1b）。
研究首先对复合材料Fe3O4@Ti3C2@PEI@DSP@aptamer的构建进行了表征（图2）。X射线衍射（XRD）分析证实了Ti3C2单层的成功合成，同时XRD结果显示了Fe3O4特征峰，证明了Fe3O4纳米粒子的成功合成并与Ti3C2结合。能量色散X射线光谱（EDX）显示Ti、Fe和O元素的明确存在和适当分布，证实了化学合成的成功。此外，元素映射分析进一步揭示了这些元素在复合材料中的具体分布情况，为材料的均匀性和功能性提供了证据。
在富集效果的表征中，研究人员通过将复合材料Fe3O4@Ti3C2@PEI@DSP@aptamer与HepG2细胞培养基中的外泌体混合，使用TEM观察到大量外泌体被该材料成功吸附（图3b）。进一步的实验显示，随着Fe3O4@Ti3C2@PEI@DSP@aptamer用量的增加，外泌体的捕获效率显著提高，最高可达近90%（图3c）。接着研究人员将这种新型富集方法与传统的超速离心方法进行了对比，发现通过Fe3O4@Ti3C2@PEI@DSP@aptamer富集的外泌体保持了典型的杯状结构（图3d），而超速离心则导致部分外泌体损伤（图3e），表明新方法在保持外泌体结构完整性方面具有明显优势。除此之外，在创伤愈合试验中，两种方式富集的外泌体均表现出60%的细胞迁移率，而对照组仅为30%，证明了富集的外泌体保留促进亲本细胞增殖和迁移的生物活性。
在检测性能的优化和表征上，图4a验证了传感器的检测原理。当未有FAM-ssDNA连接时，曲线d、e表明了其他材料对荧光检测没有影响。曲线c证明了FAM-ssDNA与适配体连接时，与Ti3C2发生荧光淬灭现象。而当外泌体加入后，FAM-ssDNA从Ti3C2表面脱离，曲线b恢复荧光强度。但仍有FAM-ssDNA残留在Ti3C2表面，导致荧光强度无法恢复至曲线a的强度。
为提高检测的特异性和灵敏度，设计了三种不同的FAM标记探针，这些探针分别靶向适配体的不同结合区域。Probe 3在实验中表现出的最高信噪比（S/N），能更准确地区分实验样本中外泌体的存在与否。除此之外，该传感器的最佳孵育温度为4℃，最佳孵育时间为60 min。
最后对检测性能进行分析，得出该传感器的线性检测范围为105~1010个/mL，检测限为4.21×104个/mL。研究人员还使用来自HepG2细胞的外泌体，进行了一系列实验来测试不同浓度外泌体在模拟血清中的检测表现。结果表明，即使在存在多种潜在干扰物的情况下，该方法仍然能够高度特异地检测到外泌体，且未观察到显著的交叉反应或干扰（图5）。
