三螺旋DNA可以用于调节基因表达或修饰DNA 结构和构象，这意味着三螺旋形成寡核苷酸（TFOs）可以作为一种潜在的基因治疗剂，因为它可用于特异性调节DNA重复转录、修复和重组；TFOs通过与特定基因调控区域结合并与转录因子竞争来抑制特定基因转录。利用这种特性，TFOs在基因治疗，尤其是癌症治疗中发挥很大作用。H-DNA是一种具有镜像对称性的高嘧啶：高嘌呤重复序列的分子内三螺旋DNA结构。H-DNA可以作为调控元件激活或抑制转录，H-DNA通过诱导双链断裂、缺失或易位驱动基因组不稳定性。 三螺旋DNA结构的这些既定作用激发了TFOs作为分子工具甚至作为治疗策略的利用。
南京大学的陈加余教授团队联合南京科络思生物科技有限公司的陈南团队设计了一种高灵敏高特异性的化学探针用于检测内源性三螺旋DNA和蛋白质之间相互作用，揭示了3种不同的结合方式并验证了部分内源性蛋白质对三螺旋结构诱导的DNA损伤的抵抗功能。
如图1，研究者基于目前已知的与三螺旋DNA特异性结合的化合物中选择了具有低细胞毒性和高渗透性的苯并喹喔啉（BQQ），并对BQQ进行双吖丙啶的标记（photo BQQ），末端炔基用于连接生物素，后续通过链霉亲和素修饰的磁珠进行富集。研究者首先通过Dral切割试验验证了photo BQQ对三螺旋DNA的稳定作用和特异性，然后通过蛋白下拉实验和活细胞荧光共定位证实了photo BQQ可以在生理条件下成功分析活体中与tsDNA相互作用的蛋白质。
图1用于检测与三螺旋DNA相互作用的蛋白质的探针设计
之后，研究者对A549和Hela细胞下拉试验获得的蛋白质进行基于串联质量标签的蛋白质组学分析（图2），分别得到349和82种候选蛋白质，两种细胞重合蛋白质种类高达78种，具有高度一致性，对其分析发现其中24种候选蛋白质是物理结合三螺旋DNA的靶向蛋白质，13种具有解旋酶活性，18种具有改变DNA构象变化活性，这位三螺旋结构在转录调控和基因组失稳都提供了证据，同时在组学角度证明了该策略鉴定与三螺旋DNA相互作用的内源性蛋白质方面的有效性。
图2基于TMT的定量蛋白质组学原位分析
基于上述研究，研究者对该策略进行了基于竞争的化学蛋白质组学分析，图3展示了BQQ与photo BQQ的成功竞争，为前面得到的候选蛋白质非假阳性提供了依据，进一步验证了候选蛋白质与内源性三螺旋DNA之间存在相互作用。
图3基于竞争的化学蛋白质组学分析
如图4，通过ChIP-seq、CUT＆Tag、S1-END-seq和圆二色谱在天然染色质背景下分析了不同的候选蛋白质与内源性三螺旋DNA的可能结合位点，发现候选蛋白质对（近）高嘧啶:高嘌呤序列具有偏好性，并提出了三种内源性蛋白质和内源性三螺旋DNA的结合特性。
图4与三螺旋DNA相互作用的蛋白质的结合特性
此外，研究者提出具有ATP依赖性RNA解旋酶活性的候选蛋白质DDX3X很可能同样具有三螺旋DNA的解旋活性，通过对三种具有不同突出端的三螺旋DNA进行酶切实验和凝胶电泳分析得到DDX3X的确具有对5’突出端的三螺旋DNA具有解旋酶活性，且并不依赖ATP。之后对DDX11、DHX9等候选蛋白质同样分析得到均对不同突出端的三螺旋DNA具有解旋酶活性，提出假设——细胞可能采用不同类型的三螺旋DNA解旋酶来调节不同形式的三螺旋结构。
图5 DDX3X的ATP非依赖性三螺旋DNA解旋活性验证
最后，研究者对活细胞中的DDX3X表达基因敲低，发现内源性三螺旋DNA结构显著上升，与之一同显著增加的是DNA损伤分子标志物γ-H2AX，并且二者存在荧光共定位现象（图6）。进一步通过组学分析发现二者的结合位点高度重合，初步验证了DDX3X可以降低内源性三螺旋DNA诱导的DNA损伤。之后，研究者通过线性扩增介导的聚合酶链式反应（LM-PCR）验证得到DDX3X可以特异性地阻止H-DNA诱导的DSB形成从而防止DNA的损伤。
图6 DDX3X预防三螺旋DNA诱导的DNA损伤效果评价
