变构转录因子（aTF）通过小分子结合诱导的构象变化来调节基因表达。尽管aTF被广泛用作生物传感器，但由于配体结合残基的突变往往会破坏异构体，因此设计aTF以检测新配体具有挑战性（图1a）。Srivatsan Raman团队开发了Sensor-seq平台，用于设计能识别非天然配体的变构转录因子（aTF）生物传感器。该平台筛选了17,737个aTF变体，针对8种配体进行实验，并通过RNA-Seq技术鉴定出具有高动态范围和特异性的生物传感器。研究发现，蛋氨酸-芳香族相互作用对配体结合至关重要。此外，还开发了纳曲酮和奎宁的无细胞检测系统，证明了传感器测序技术在设计新型生物传感器中的潜力和实用性。
Sensor-seq技术结合配体诱导和深度测序，用于评估aTF变体库（图1b）。它通过RNA-seq测量转录水平来量化变体活性，并计算F分数（图1c）。该技术能关联变体与转录条形码，识别响应特定配体的变体。通过高通量筛选，可以分析变体库对多种配体的响应（图1d）。实验中，16个TtgR变体对柚皮素的反应通过Sensor-seq和qRT-PCR验证，显示高相关性（R²=0.83）（图1e,f）。Sensor-seq在减少条形码数量时仍保持准确性，降低成本，适用于大规模蛋白质库分析（图1g）。
利用Sensor-seq技术，研究人员从FuncLib生成的17,737个TtgR变体库中筛选出对九种配体（包括两种天然和七种非天然）有特异性反应的变体来开发新的生物传感器（图2a）。筛选结果显示，部分变体对非天然配体有强烈反应，而有些则增强了对天然配体的活性（图2b）。这些变体不仅展示了对不同配体的特异性，还能区分结构相似的配体（图2c）。通过GFP法进一步验证，确认了变体的高动态范围和特异性（图2d-f）。这项研究不仅揭示了TtgR变体的独特特异性剖面，还证明了TtgR等蛋白质对多样化配体家族的适应性。研究者利用Sensor-seq技术，结合物理化学嵌入、UMAP技术和HDBSCAN聚类算法，分析了17,430个TtgR变体的11个突变位置，将其分为23个聚类，每个聚类代表具有相似物理化学属性的序列集合(图3a）。通过UMAP投影和F分数分析，发现不同配体的功能序列分布在多个聚类中，显示了多种序列解决方案（图3b）。进一步分析揭示了不同聚类对配体的性能差异，以及TtgR对每种配体增益功能响应的序列决定因素。例如，羟基化他莫昔芬衍生物与N-去甲基他莫昔芬和他莫昔芬的响应聚类不同，而金鸡纳碱和纳曲酮的独特聚类特征显示特定序列控制对这些配体的特异性。柚皮素和丙酸氯倍他索的响应序列广泛分布，表明对这些天然配体的响应对突变通常对突变鲁棒（图3c）。这项研究不仅揭示了TtgR适应多样配体的突变适应性，还为设计和理解蛋白质-配体相互作用提供了宝贵的机器学习资源。图2 Sensor-Seq识别非天然配体的aTF变体TtgR与纳曲酮结合的四重变异体的高分辨率晶体结构揭示了其与配体相互作用的结构基础，TtgR有大配体结合口袋（1500ų），可结合多种配体，其配体特异性通过口袋内氨基酸旋转状态改变增强，主要靠范德华相互作用。纳曲酮结合结构中，四个变异利于包装纳曲酮并排除其他配体（图4a），变异体还增强与纳曲酮的范德华相互作用及特异性，参与Met-Aro相互作用增强蛋白质稳定性和配体亲和力（图4b），C137和R75旋转扩大通道，这些特征共同促进TtgR对纳曲酮的高亲和力结合（图4c），拼图式配体-aTF相互作用的稳定能量和更大入口通道有助于纳曲酮被TtgR容纳。图4 晶体结构揭示非天然配体相互作用的蛋白质稳定基序最后构建了检测纳曲酮和金鸡纳碱的无细胞生物传感器，选用3A7和2F9两个变体进行测试（图5a），验证了3A7传感器在无细胞反应中抑制荧光报告基因的能力及对不同浓度纳曲酮的响应，发现纳曲酮浓度增加时荧光信号增强，在10 nM到100 µM范围尤为明显（图5c）；还测试了2F9变体传感器对不同浓度金鸡纳碱的响应，100 nM时荧光信号2 h内可区分，6-8 h达翻倍稳态水平，200 nM时荧光信号总体下降，可能因金鸡纳碱的DNA插入性质有毒性影响（图5e）。通过比较两者的剂量反应，为无细胞检测提供了希望，未来可优化其在废水和生物流体等基质中的应用。1.Sensor-seq技术融合了系统发育引导的序列多样性和RNA条形码体系，通过深度测序筛选aTF变体，实现了高灵敏度和高通量筛选。2.相较于细胞分选和基于板的筛选方法，Sensor-seq能够在不增加实验复杂性的前提下，检测到更多的变异。3.在对细菌人工合成转录因子TtgR的特异性进行重新设计时，Sensor-seq产生的变体在多个非天然配体上展现出强烈的活性，同时对天然配体的活性和特异性也有所提升。4.统计分析涵盖了近160,000个序列功能数据点，揭示了功能获得的顺序性决定因素，为蛋白质-配体相互作用提供了深刻的见解。1. 本文版权归原作者所有，公众号和媒体转载请与我们联系！2. 因学识有限，难免有所疏漏和谬误，恳请批评指正！3. 本文主要参考以下文献，仅用于对相关科学研究的介绍、评论或课堂教学，不得作为商业用途。如有任何版权问题，请随时与我们联系！Nishikawa K
K, Chen J, Acheson J F, Harbaugh S V, Huss P, Frenkel M, Novy N, Sieren H R,
Lodewyk E C, Lee D H, Chávez J L, Fox B G, Raman S. Highly multiplexed design
of an allosteric transcription factor to sense new ligands[J]. Nature
Communications, 2024, 15(1): 10001.
