为了研究与核酸适配体Apt-C4 结合的靶蛋白，团队首先进行了 pull-down trolling 蛋白实验。实验的基本前提如图 1A 所示。生物素修饰的核酸适配体对靶蛋白和链霉亲和素磁珠均表现出特异性结合。因此，与核酸适配体复合的蛋白质也被固定在磁珠上。通过热变性洗脱附着在磁珠上的蛋白质，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验以确定与 Apt-C4 复合的靶蛋白的分子量。实验结果可见，泳道 4 和 7 表现出15 到 25 kDa 之间的条带，与其他组不同。
图 1. 采用Pull-down 法查找核酸适配体的靶蛋白
随后，团队进行了候选靶标蛋白的分析，依据凝胶图谱确定目标条带位置在 15 - 25 kDa 之间，由于该核酸适配体结合蛋白为分泌蛋白，所以从分子量在此范围的蛋白中挑选出 14 种分泌蛋白进行后续研究。查询 Uniport 数据库官网后，得到候选蛋白的功能信息，综合质谱结果（表 1）显示，PPIA蛋白在相关数据中表现出数量上的优势，所以被选定为本研究进一步研究的候选蛋白。
随后，团队从 Uniport 数据库中检索并使用X 射线方法以 1.38 Å 分辨率测定的PPIA 蛋白的结构（图2）。PPIA 蛋白的氨基酸序列如图2C所示。同时，使用EMSA 凝胶封闭试验验证核酸适配体与 PPIA 蛋白的结合特异性，如图2B 所示，从左到右泳道 1-5 分别为 Apt-C4与不同浓度PPIA蛋白孵育后的条带（0.5 μg、1μg、2 μg PPIA 蛋白和10 μg BSA 蛋白）。可以观察到，阻塞条带与 PPIA 蛋白浓度的增加成比例地变暗。此外，添加 BSA 不会对适配体产生任何抑制作用，这表明 PPIA 蛋白对核酸适配体表现出特异性结合亲和力。然而，由于引入的核酸适配体数量较高，该蛋白质仅阻碍有限部分核酸的迁移，大部分核酸随电泳迁移。
图2 .PPIA蛋白和 Apt-C4 的特异性结合研究
团队使用胶体金验证核酸适配体与 PPIA 蛋白的结合亲和力。通过优化 NaCl 浓度（图3），确定能充分诱导 AuNPs 聚集的NaCl 的最小浓度为0.72 M；通过Apt-C4浓度优化（图3CD）结合实验成本分析，确定适配体 Apt-C4 的最佳浓度选择为 1μM。在最佳实验条件下，对适配体 Apt-C4 进行亲和力计算，如图 3E 和3F 所示，随着 PPIA 浓度的增加，每个核酸适配体（A620/A520）×1000的吸光度比逐渐增加，然后在 43.75–1400 nM 的浓度下保持不变。此时，金纳米颗粒、核酸适配体和 PPIA 蛋白的结合达到平衡，PPIA蛋白与 Apt-C4 的亲和力分别为5.989±2.017 nM。
图3 通过胶体金法验证PPIA 蛋白与 Apt-C4 的结合亲和力
为了探索 Apt-C4 和PPIA 蛋白的结合机制，团队进行了 Apt-C4 与PPIA 蛋白的分子对接，如图 4A 所示。通过 Pdbepisa 分析对接结果，得到适配体与 PPIA 蛋白结合时的 Gibbs 自由能。Apt-C4和 PPIA 蛋白之间的相互作用力包括疏水、氢键和盐桥。显示了当核酸适配体与靶蛋白结合时，有助于氢键力的碱基。团队保留了结合位点，并截短了 Apt-C4。获得3 个候选截短适配子 Apt-S61 、Apt-S43 和 Apt-Z43。它们的二级结构列如图4C 所示。值得一提的是，截短适配体的吉布斯自由能与原始适配体相比变化不大，同时二级结构与原始适配子的上部相同。
图4 Apt-C4 和PPIA 蛋白分子对接和截短适配体
使用 Haddock 进行分子对接模拟，得到最优对接构象（图5），只有 Apt-S61 的对接分数为负，PLIP分析的 Gibbs 自由能低于Apt-C4。与原始适配体相比，Apt-S61 的氢键数量保持不变。然而，结合位点发生了变化。因此，即使核酸适配体的二级结构保持不变，截断仍然会影响与目标蛋白结合位点的改变。因此，必须对截短核酸适配体与 PPIA 蛋白的结合亲和力进行实验验证。
图5 截短适配体和PPIA 蛋白的对接结果
团队同样使用胶体金验证截短核酸适配体的结合亲和力，图 6A 所示，三种核酸适配体在1μM 浓度下表现出胶体金的最佳分散性，A620/A520 比率最低。核酸适配体Apt-S61 对 PPIA 蛋白的亲和力为4.161±0.5311 nM，与原始适配体相比有所增加，而 Apt-S43 和Apt-Z43 对 PPIA 蛋白的结合亲和力为阴性。因此，3 个截短的核酸适配体，只有 Apt-S61 与PPIA 蛋白具有良好的亲和力，与分子对接结果一致。使用胶体金法研究 Apt-S61 与PPIA 蛋白结合的特异性，如图 6E 所示，BSA 蛋白的A620/A520 值低于 PPIA，特异性良好。
图6 通过胶体金法验证截短适配体与 PPIA 蛋白之间的亲和力
最后，团队构建 Apt-S61 无标记核酸适配体生物传感器检测 PPIA 蛋白，检测原理如图 7A所示，一旦核酸适配体与蛋白质结合，荧光值就会随着 EVA 染料的加入而降低。团队验证了传感器制备的成功和检测范围的可行性以及传感器的特异性。该方法的最低检出限为 0.008μg/μL，检测范围为0.008–0.1μg/μL，该检测方法快速简单，但灵敏度较差，因此未来计划需要使用信号放大来提高灵敏度，实现结直肠癌的早期诊断。
