Florian Hollfelder: 通过适配体传感器实现液滴中色氨酸合酶的超高通量进化

文摘   2024-11-12 18:30   北京  

色氨酸合酶催化多种非经典氨基酸的合成,是定向进化的有吸引力的靶标。液滴微流体提供了一种超高通量的定向进化方法,能够在序列空间的更广泛区域搜索生物催化剂,并将试剂消耗量降至皮升体积,本篇文章色氨酸合酶需要一种新的检测方法。色氨酸在可见光谱中不发荧光,因此不属于传统液滴微流体读数的范围,后者与高通量的紫外光检测不兼容。在这里,我们将色氨酸DNA适体设计到传感器中,以定量报告液滴中色氨酸的产生。

从现有的L-色氨酸Trp DNA适体中开发了一种适配体传感器,用于色氨酸合酶β-亚基的超高通量进化uHTS进化,简称TrpB。它浓缩L-丝氨酸Ser和吲哚以产生Trp

首先,表达TrpB的细胞与适配体传感器和裂解试剂进行封装在单个液滴中,接下来裂解试剂将细胞裂解,释放TrpB,同时催化底物形成最终产物Trp,在产物存在时,适配体传感器就会荧光激活。而后再次将其封装在液滴中,与荧光激活细胞流式进行分选,最后回收高催化活性的变体(1)

整个分选过程概述


随后,实验研究了最优互补链的长度,通过2可以看出,互补9 nt时,荧光降低一半,表明有50%的适配体并没有结合,对于互补15 nt,它的结构过于紧密,并不能破坏其二级结构,所以通过荧光信号变化量得出互补10 nt时效果最好。

适配体传感器搭建


随后对特异性和其TrpB纯化后的变体进行实验验证,发现其可以对同类型的氨基酸识别,而对于三种突变体分别在微孔和液滴中进行对于K82A突变体,他自身突变为丙氨酸,所以荧光降低,通过图3也能观察到7E6突变体相比于另外两种荧光值更高。

特异性与相容性验证

最后通过2步筛选,第一步通过微滴板进行筛选,目的是为了去除活性低的突变体。第二步是通过流式进行分选,选择最终的突变体A9,它比野生型的催化效率高2.5倍。



点 评

1. 将DNA适体重新利用成为Trp的特异性传感器来开发一种检测系统,并使用该传感器检测液滴中Trp的形成。

2. 监测液滴中的Trp水平能够进化TrpB,催化吲哚衍生物和Ser缩合成各自的Trp衍生物。

3. 在不依赖反应产物的内源性光学信号的情况下实现生物催化剂的超高通量进化。


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R.A. Scheele, Y. Weber, F.E.H. Nintzel, M. Herger, T.S. Kaminski, F. Hollfelder, Ultrahigh Throughput Evolution of Tryptophan Synthase in Droplets via an Aptamer Sensor, ACS Catal 14(8) (2024) 6259-6271.

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