色氨酸合酶催化多种非经典氨基酸的合成,是定向进化的有吸引力的靶标。液滴微流体提供了一种超高通量的定向进化方法,能够在序列空间的更广泛区域搜索生物催化剂,并将试剂消耗量降至皮升体积,本篇文章色氨酸合酶需要一种新的检测方法。色氨酸在可见光谱中不发荧光,因此不属于传统液滴微流体读数的范围,后者与高通量的紫外光检测不兼容。在这里,我们将色氨酸DNA适体设计到传感器中,以定量报告液滴中色氨酸的产生。
从现有的L-色氨酸(Trp) DNA适体中开发了一种适配体传感器,用于色氨酸合酶β-亚基的超高通量进化(uHTS)进化,简称TrpB。它浓缩L-丝氨酸(Ser)和吲哚以产生Trp。
首先,表达TrpB的细胞与适配体传感器和裂解试剂进行封装在单个液滴中,接下来裂解试剂将细胞裂解,释放TrpB,同时催化底物形成最终产物Trp,在产物存在时,适配体传感器就会荧光激活。而后再次将其封装在液滴中,与荧光激活细胞流式进行分选,最后回收高催化活性的变体(图1)。
随后,实验研究了最优互补链的长度,通过图2可以看出,互补9 nt时,荧光降低一半,表明有50%的适配体并没有结合,对于互补15 nt,它的结构过于紧密,并不能破坏其二级结构,所以通过荧光信号变化量得出互补10 nt时效果最好。
随后对特异性和其TrpB纯化后的变体进行实验验证,发现其可以对同类型的氨基酸识别,而对于三种突变体分别在微孔和液滴中进行对于K82A突变体,他自身突变为丙氨酸,所以荧光降低,通过图3也能观察到7E6突变体相比于另外两种荧光值更高。
最后通过2步筛选,第一步通过微滴板进行筛选,目的是为了去除活性低的突变体。第二步是通过流式进行分选,选择最终的突变体A9,它比野生型的催化效率高2.5倍。