目前，荧光成像受限于光的低组织穿透率，导致成像深度浅。高分辨率分析通常仅限于组织表面和切片，因此很难以细胞级分辨率详细分析整个器官。本文通过点击化学反应和组织透明化技术提高组织成像深度，实现高分辨率的三维荧光成像。
利用一种多聚甲醛（PFA）固定和脱脂的圆柱形肝组织块的实验测定法，以评估点击反应的染色深度。同时使用IAM-hexyl（一种与硫醇的竞争反应物）和IAM-hexynyl成功使炔烃标记的探针标记在肝组织块中。随后，在各种条件下用叠氮化物荧光染料对炔烃标记的圆柱形肝组织块进行CuAAC处理。然后用BABB（苯甲醇/苯甲酸苄酯 = 1：2）使组织透明，并使用光片荧光显微镜成像。使用这种方法，同先前文献报道的CATCH方法和Method A方法做了比较。结果得到，文献先前报道的方法约为200至300 μm，对相对较薄的切片有效，但它们不适用于大型器官水平的样品。
在这项研究中，分别对Cu，Cy5标记的叠氮化物、抗坏血酸钠、Cu配体、NaCl浓度进行优化。结果表明铜催化剂浓度的变化不会显著影响染色深度，Cy5-azide浓度增大可提高反应活性，不会影响染色深度。高浓度的 NaAsc大大改善了染色深度，随着铜催化剂浓度从0.3 mM增加到2 mM，高浓度的NaAsc导致染色深度更大。此外，还探究了BTTP、THPTA和BTTAA三种铜配体对点击染色深度的影响，结果得到BTTP有较多的叔丁基，可稳定Cu离子，并可能有助于提高反应性。THPTA在反应性和渗透性之间表现出最佳平衡。THPTA被认为比BTTP和BTTAA更适合3D组织中的点击反应。增加盐浓度对点击试剂的组织渗透性有一定的影响，但影响不大。最终确定了Click3D协议，该方案包括用于Cu预孵育的Click3D-C、用于反应的Click3D-R和用于洗涤的Click3D-W。该方法相较传统方法而言，染色深度有显著改善。
使用RNA合成标记物5-乙炔基脲（5-EU），一种炔烃标记的尿苷类似物，对小鼠中的新生RNA进行成像。由于5-EU在体内被掺入新生RNA中，因此其随后的点击染色可实现RNA转录的可视化。横断面分析显示，信号在皮层中特别强，尤其是在内侧。然而，并非所有小管都被检测到，这表明不同甚至相同类型的小管之间RNA转录活性可能存在差异。在没有5-EU的载体对照组中，在相同的成像条件下信号可以忽略不计。当使用CATCH和方法A等常规方法对5-EU给药的样品进行染色时，观察到有限的染色，证明了Click3D的卓越染色深度。
接下来研究专注于应用功能性化学探针来靶向缺氧。Pimo-yne是哌莫硝唑（Pimo）的炔烃标记衍生物，是低氧区域染色的金标准。HIF-1阳性区域分布在血管附近的轻度缺氧中，与Pimo阳性区域不同，据报道，HIF-1阳性区域分布在远离血管的严重缺氧中。因此，HIF-1、Pimo和血管的详细3D映射可以加深对肿瘤缺氧的理解。利用该方法的实验结果成功证明 HIF-1（绿色）、Pimo-yne（红色）和血管（青色）同时染色。详细分析显示HIF-1和Pimo-yne的阳性区域位置紧密但明显，表明HIF-1和哌莫硝唑检测到的氧浓度范围不同。
然后，使用了低氧血症的小鼠模型。结果成功检测到低氧血症诱导的整个大脑的荧光信号。为了进行比较，研究者使用哌莫硝唑-荧光团偶联物Pimo-Me-Si-Rhodol和Pimo-BODIPY进行了类似的实验，然而，这些探针几乎没有产生脑缺氧的实质性信号。
