传统流式技术主要是使用荧光基团来对细胞内的各个蛋白质进行检测，正因如此，也被称为荧光流式。但目前可供使用的荧光基团数量相对有限，在实验室的常用情况中，通常还不到12个。同时各荧光基团的发射谱带较宽，相邻谱带之间重叠问题严重，这就导致一次分析中能够同时检测的通道数量受到了相当大的限制。
基于以上研究背景，哈佛大学Wyss研究所的尹鹏教授团队构建了Amplification by Cyclic Extension（ACE）技术，可同时放大30种以上蛋白表位信号，主要应用在悬浮质谱流式和成像质谱流式（imaging mass cytometry或IMC）中，且研究证明ACE皆可大幅提升低丰度蛋白信号检测的灵敏度及准确性。该文章今年7月发表于Nature Biotechnology，并且近几年针对信号放大及成像领域，该团队现有的一系列DNA纳米技术成像技术，包括DNA-PAINT、Discrete Molecular Imaging（DMI）、Immune-SABER及本篇文章中提及的ACE技术，已经推动了超分辨率显微镜的研究领域的进展，进一步实现原位成像，提升复杂背景下蛋白质成像功能。
在22℃下，反应体系内的延伸探针（Extender）与起始探针（Intiator）上互补结合，体系中的Bst DNA聚合酶应用延伸探针为模版延长起始探针。提高体系温度后，延伸探针从延长过起始探针上解离，此时一个反应循环结束。当体系温度再次降低时，下一个延伸循环开始，起始探针进一步被延长。通过对起始探针序列的温控循环延伸，ACE可快速复制金属检测探针（Detector）结合位点，引入检测探针后，单个抗体所携带的金属同位素标记物数量大幅提升。为了提升DNA结构的热稳定性，该团队又结合3-cyanovinylcarbazole phosphoramidite (CNVK)紫外交联方法将携带金属标记的检测探针共价结合在延伸后的起始探针上，使得检测探针在质谱流式仪内高温环境中不易解离。
图1 ACE原理图及其应用
ACE前100个循环（约2小时）中是最有效的，之后扩增效率随着时间的推移而下降，不会给质谱流式细胞仪信号的线性带来偏差。同时用33个起始链单独标记，ACE一管内反应，说明大多数引发剂序列只能通过其相应的延伸剂和检测器来延伸和检测，表明该反应的特异性（图2）。
图2 用于质谱流式细胞仪信号放大的ACE验证和定量
应用32参数的ACE组合，研究了小鼠Py2T细胞在上皮-间质转化（EMT）及相对较少研究的间质-上皮转化（MET）过程中的分子重编程，表明Zeb1与Cyclin B1的表达比例可以作为MET过程中细胞的标志物，体现ACE的高敏感性（图3）。
图3 多重ACE分析EMT和MET过程中转录因子表达水平差异诱导的分子调节
使用ACE同时扩增了人类Jurkat T细胞和原代人类CD4+T细胞中的30个T细胞受体（TCR）信号传导标志物，可以实现对TCR信号网络在1小时刺激时间内的全面分析。此方法揭示了信号传导级联中的细微动力学变化，结果表明ACE能够以单细胞分辨率对TCR信号网络进行全面分析（图4）。
图4 ACE能够以单细胞分辨率进行全面的TCR信号网络分析
通过将T细胞与人类患者术后引流液（POF）共培养，应用ACE进一步表征T细胞信号传导的抑制调节，以响应源自组织损伤部位周围环境的信号。基于ACE的TCR信号网络分析可用于以单细胞分辨率探索组织损伤后免疫抑制的分子机制，并有可能确定未来治疗干预的靶点（图5）。
图5 ACE表征POF样品共培养物调节的T细胞信号网络动态
研究结合ACE与成像质谱细胞术（IMC），对所有标记物进行ACE线性扩增，对10个低丰度肾脏标记物应用ACE分支扩增，分析了人类肾脏组织的结构组织和表型异质性，主要涉及肾皮质中的六个主要区域，揭示了多囊肾病中干细胞标志物的异质性表达（图6）。
图6 ACE增强了基于 IMC 的多参数组织分析
2. Bst酶的链置换活性有新应用场景。
