目前，将治疗性物质有效装载到细胞外囊泡中并保持其活性和完整性是一项挑战。现有技术包括主动装载和基因工程，但存在规模化生产和纯化难题。一种新策略是通过增强货物与细胞脂质膜的关联来装载货物，例如将蛋白质货物融合到跨膜结构域或膜靶向序列。这种方法虽然有效，但对货物的功能递送控制有限，且其机制尚不完全清楚。探索膜-蛋白相互作用，以实现蛋白的天然运输和装载到细胞外囊泡，可能为提高装载效率提供新策略。
接下来，作者提出通过分析脂筏相关蛋白质的特性来设计能有效装载到细胞外囊泡中的蛋白质。研究发现，单通道跨膜蛋白中，与脂筏和细胞外囊泡相关的蛋白质具有较长的跨膜结构域和较高的棕榈酰化水平；而在多通道跨膜蛋白中，这些特征没有显著差异。在外周膜蛋白中，脂筏和细胞外囊泡相关蛋白显示出特定的脂化基团，尤其是棕榈酰化和异戊烯化（图2e-g）。这些相似的性质和化学特征支持了细胞外囊泡富含脂筏相关蛋白的观点。
作者选取T细胞活化连接子（LAT）作为模型蛋白，研究了蛋白质的物理特性对脂筏-蛋白相互作用、蛋白质运输和细胞外囊泡负载的影响。通过HaloTag标记，生成了野生型LAT（WT）、非棕榈酰化突变体LAT（C26A）、跨膜结构域缩短的LAT（dCore）和跨膜表面积增加的LAT（高ASA）等融合蛋白。实验结果（图3）表明，野生型LAT在质膜上的定位比突变体更明显，且更易分配到脂筏上。在细胞外囊泡的蛋白质负载分析中，野生型LAT和高ASA在HS-EV和UC-EV中的装载程度更高，尤其是野生型LAT在细胞外囊泡中的分配最高。
作者设计了两组多通道跨膜蛋白复合物：4TMD（四个跨膜结构域）和12TMD（十二个跨膜结构域），并将mRFP1融合到它们的C端（图4）。结果表明，在活细胞中增加跨膜结构域长度可以增强质膜定位，与LAT蛋白的结果一致，显示蛋白质定位与跨膜结构域长度正相关。但在巨质膜囊泡中，所有结构均未定位于脂筏，表明蛋白脂化对脂筏关联至关重要。跨膜结构域长度与4TMD的EV负载和分配正相关，而12TMD中未观察到此趋势。
然后，作者通过将不同脂质修饰的蛋白质序列融合到HaloTag中，创建了五种“脂质标签”：非脂化（Sol）、豆蔻酰化（M）、棕榈酰化和肉豆蔻酰化（PM）、两个棕榈酰化和一个法尼基化（PPF）、牻牛儿基化（G）。在HEK293FT细胞中，非脂化的HaloTag未定位到质膜，而单个脂化位点（M、G）足以定位到质膜，多个脂质位点（PM, PPF）则增强了与质膜的联系。在巨质膜囊泡中，PM和PPF标签与脂筏的关联更强。脂化增加了HaloTag在HS-EV和UC-EV中的负载，尽管G标签不驱动脂筏关联，但能提高细胞外囊泡的负载。结果表明，脂筏关联虽能驱动蛋白质装载，但非必需，而PM和PPF标签最有效地驱动蛋白装载到细胞外囊泡中。
如图6所示，作者系统评估了HS-EV和UC-EV装载和细胞外囊泡分配如何与细胞运输、脂质相互作用和细胞外囊泡特性数据相关，结果表明质膜定位和筏关联与HS-EV和UC-EV分配呈正相关，有力地支持了质膜和筏定位是蛋白质分配到细胞外囊泡的关键参数的假设。
最后，作者还研究了通过增强脂筏关联和细胞外囊泡（EV）负载来实现工程化EV治疗的潜力，并评估了修饰生物活性蛋白以增强其在受体细胞中的功能传递和释放。结果表明，脂化synTF（合成转录因子）在一定程度上影响了报告基因的表达，而脂化synTF的EVs能有效介导功能变化，尤其是PM标签，能显著激活报告基因表达，转化7%的报告细胞。
