N-乙酰半胱氨酸（NAC）可作为吸烟引起的气道损伤的治疗或预防措施。然而，吸烟引起的损伤的确切性质和NAC的保护机制尚不完全清楚。清华大学马少华团队开发了患者组织来源的气道类器官，用于模拟吸烟引起的损伤、治疗研究和机制研究。结果表明NAC与尼古丁结合可以消除尼古丁与烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）的结合能力，从而阻止尼古丁引起的损伤。
#1
研究背景
Background
吸烟是全球健康的主要威胁之一。尼古丁是香烟中的主要化合物，它破坏屏障功能，削弱黏毛清除，从而损害宿主对呼吸道病原体入侵的防御。它还以剂量依赖的方式诱导细胞凋亡和促进肿瘤发生。尼古丁的细胞毒性在很大程度上取决于尼古丁暴露的浓度和持续时间。
烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）广泛分布于气道，尤其是纤毛细胞。nAChRs对尼古丁具有很强的亲和力，能通过影响纤毛跳动和上皮离子转运过程来调节纤毛黏液清除。暴露于香烟烟雾中可降低纤毛跳动频率。然而，尼古丁对纤毛跳动的影响在不同的研究中有所不同。动物细胞的使用可能会使结果产生偏差，因为不同的物种对尼古丁治疗可能有不同的敏感性。此外，尼古丁对纤毛功能的影响可能随剂量和暴露时间而变化。在人类中，早期和轻微暴露于香烟烟雾可以刺激呼吸防御机制。然而，长期暴露于尼古丁可显著损害粘膜纤毛清除。本研究探究了香烟烟雾或尼古丁暴露对人气道上皮的影响。
N-乙酰半胱氨酸（NAC）具有抗氧化和抗炎的双重特性。它可以通过减少促炎细胞因子和自由基的产生来减轻吸烟或尼古丁诱导的细胞凋亡，能用于治疗呼吸系统疾病。此外，NAC可以通过降低黏液厚度来改善纤毛清除。NAC是否能抵消尼古丁引起的纤毛功能障碍尚不清楚。而且，目前还没有关于NAC和nAChR相互作用的报道。
气道类器官可以通过纤毛跳动和粘液分泌来重现纤毛黏液的清除。研究发现气道类器官对香烟烟雾敏感，能够用于确定吸烟损伤治疗的新方法。气道类器官模型概括了吸烟和尼古丁诱导的纤毛功能障碍。本研究评估了NAC在改善吸烟和尼古丁损伤方面的疗效。结果发现NAC可通过nAChRs与尼古丁相互作用，挽救尼古丁诱导的纤毛功能障碍和损伤。
#2
研究思路
Methods
首先，从人支气管组织来源的上皮细胞构建了气道类器官并进行表征；然后，通过将气道类器官暴露于香烟烟雾和纯化尼古丁中评估香烟烟雾及纯化尼古丁对纤毛运动的毒性和敏感性；接着，将气道类器官暴露在香烟烟雾中评价NAC对纤毛的保护作用；最后通过计算机对接模拟等多种方法阐明NAC与尼古丁和烟碱受体的相互作用。
#3
关键研究结果
Results
1、原代支气管组织源性运动气道类器官的构建
研究人员从人支气管组织来源的上皮细胞构建气道类器官（图1A）。支气管组织来源的上皮细胞在体外长时间培养后可以自组织成三维（3D）支气管球，支气管球的长期培养促进了纤毛的发育，再现了气道的跳动功能，并产生了类器官的运动(图1A)。气道类器官细胞组成的类型通过特定标记物的表达来识别：纤毛细胞的乙酰化-α-tubulin(Ac-α-Tub)，基底细胞的细胞角蛋白5(KRT5)，杯状细胞的粘蛋白5AC(MUC5AC)，肌成纤维细胞样细胞的α-肌动蛋白（αSMA）/波形蛋白（图1B）。纤毛细胞是气道类器官的主要细胞类型，被紧密连接蛋白occludens-1（ZO-1）紧密结合（图1C）。基于Ac-α-Tub和ZO-1的相对位置，气道类器官呈现“尖向外”极化(图1D)。Ac-α-Tub覆盖气道类器官的外表面，而ZO-1位于根尖表面下方(图1D)。纤毛的超微结构以典型的“9+2”微管排列为特征，由2个中心微管被9个外部微管偶联包围(图1E)。
图1 气道类器官的建立与表征。
2、纤毛运动性作为香烟烟雾毒性的敏感生物力学指标
为了评估香烟烟雾对运动纤毛的毒性，研究人员将气道类器官暴露在ALI装置中香烟烟雾的气相中。结果表明，香烟烟雾的气相损害了纤毛功能(图2A)。纤毛跳动活性随着长时间暴露于烟雾的气相而逐渐下降（图2A）。增加香烟浓缩物浓度和处理时间会损害气道类器官的纤毛跳动功能（图S6），进一步表明纤毛对香烟引起的功能障碍的敏感性。而且，纤毛跳动活性较高的气道类器官中活细胞的比例增加。纤毛跳动功能的损害早于细胞死亡的出现(图S7)，提示纤毛跳动活动可能是早期检测香烟所致损伤的敏感生物力学标志物。此外，纯化尼古丁以一种时间依赖性的方式减弱了纤毛跳动，这表明尼古丁对纤毛跳动功能有毒性作用（图2B）。
图2 跳动的纤毛对香烟烟雾的气相或尼古丁的敏感性。
图S6 在9小时的观察期内，香烟浓缩物以浓度依赖的方式降低纤毛跳动频率。
图S7 睫状肌跳动活动受损是气道损伤的早期指标。
3、将气道类器官暴露在香烟烟雾中评价NAC对纤毛的保护作用
为了模拟真实场景中的吸烟和NAC治疗，使用气溶胶NAC治疗后，在ALI设置中将气道类器官暴露于香烟烟雾的气相中。结果发现，吸入NAC可保护气道类器官免受吸烟引起的纤毛功能障碍(图S12)。而且，NAC溶液预处理的气道类器官以浓度依赖的方式预防吸烟引起的纤毛功能障碍，增加NAC浓度还能延长气道类器官模型的保护时间(图S13)。此外，NAC处理可以抵消香烟浓缩液的毒性，从而防止香烟浓缩液引起的纤毛功能障碍(图S14)。
接下来，进一步研究了NAC是否可以保护细胞免受香烟浓缩液诱导的凋亡。结果发现，NAC处理显著增加了暴露于香烟浓缩液的HBECs在9小时内的活细胞比例，降低了凋亡细胞比例（图S15）。与低剂量相比，高剂量NAC的保护作用更为明显（图S15）。这表明NAC对香烟浓缩液毒性有较好的抑制作用。在研究的9小时时间框架内，将NAC浓度增加到20mm并没有显著增加其对HBECs的潜在细胞毒性（图S15）。此外，NAC对气道类器官纤毛跳动功能没有明显副作用(图S16)。这些结果表明，气道类器官可用于评估药物治疗吸烟损伤的有效性和安全性。
图S12 NAC气雾剂可预防香烟烟雾引起的睫状肌功能障碍。
图S13 NAC溶液以浓度依赖的方式防止香烟烟雾诱导的睫状肌功能障碍。
图S14 NAC对香烟浓缩物诱发的睫状肌功能障碍的影响。
图S15 NAC可防止香烟浓缩物诱导的细胞凋亡。
图S16 NAC对气道器官组织的纤毛跳动活动无明显毒性。
4、NAC可抵消尼古丁引起的睫状体损伤
研究结果表明，NAC治疗可以挽救尼古丁诱导的气道类器官纤毛功能障碍(图3)。不同时间点NAC治疗组的纤毛跳动频率均高于尼古丁组(图3)。这表明NAC对尼古丁暴露后的纤毛功能有保护作用。综上所述，这些结果表明NAC通过改善纤毛功能有效地对抗尼古丁引起的损伤。
图3 NAC可以防止尼古丁引起的纤毛功能障碍
5、NAC与尼古丁和尼古丁受体相互作用
首先确定了尼古丁受体在气道类器官中的表达和功能。NAChRα5主要富集在气道类器官的纤毛中，而nAChRα7在纤毛细胞的顶膜中比在纤毛部分更为突出（图4）。用盐酸阿地芬宁抑制nAChRs后，降低了气道类器官的纤毛跳动(图5)。这表明nAChR在纤毛跳动中起作用。尼古丁可以与纤毛中nAChR的不同亚型结合(图6A，B)，从而引起nAChR功能障碍，导致纤毛跳动减弱（图2B）。综上所述，这些结果共同表明尼古丁-nAChR通路高度参与尼古丁毒性，这反映在纤毛跳动功能上。
接下来，研究人员研究了NAC对尼古丁诱导的气道类器官纤毛功能障碍保护作用的机制。结果显示，尼古丁和NAC的结合方向或角度不同（图7）。根据计算机对接模拟，尼古丁和NAC的其他潜在结合位点也不同（图7）。这些结果表明，NAC并不直接与尼古丁竞争尼古丁受体。然后研究人员又研究了NAC和尼古丁之间的直接相互作用。根据分子相互作用过程中热力学参数和吸收光谱的变化可知，NAC能有效地与尼古丁结合(图6C)。而且，NAC与尼古丁结合可以消除尼古丁与nAChR的结合能力，从而防止尼古丁诱导的纤毛功能障碍(图6D)。在nAChR功能被阿地芬宁抑制的气道类器官中，NAC治疗无法预防尼古丁诱导的纤毛跳动功能障碍（图8）。这些发现表明，NAC的保护作用是通过nAChR的作用介导的。
如图9所示，NAC可以减少健康类器官中的活性氧（ROS）。然而，尼古丁暴露并没有进一步增加气道类器官中的ROS水平，NAC也没有显著降低尼古丁暴露的类器官中的ROS水平（图9）。这些结果表明，抑制尼古丁与nAChR结合可能是NAC的主要保护机制。
图4 气道类器官表达烟碱受体。
图5 nAChR抑制剂抑制纤毛跳动功能。
图6 NAC干扰尼古丁与尼古丁受体的结合。
图7 分子相互作用的计算机对接模拟。
图8 nAChR是尼古丁诱导的纤毛功能障碍的潜在治疗靶点。
图9 尼古丁和NAC对ROS水平的影响。
结论
本研究结果显示，NAC抑制尼古丁与气道类器官中nAChR的结合来保护气道免受香烟烟雾引起的损伤，在气雾剂制剂中施用NAC可被证明是防止香烟烟雾引起的上皮损伤的有效措施。本研究结果可能有助于利用人源化类器官探索新的机制和确定新的治疗靶点。
本研究存在一些局限性。首先，尼古丁诱导nAChR功能障碍的潜在机制仍有待阐明。其次，相对于单个细胞，完整气道类器官对环境损伤的恢复能力增强的原因尚不清楚。第三，其他香烟烟雾化合物与nAChR的结合亲和力，它们对纤毛功能的影响，以及NAC与其他香烟烟雾化合物之间的相互作用还有待研究。此外，气道上皮细胞的其他细胞亚群也可能与尼古丁引起的损伤有关，未来进一步的研究可能证明是有益的。最后，全面分析尼古丁暴露和NAC处理下气道类器官的这些变化，将进一步加深对尼古丁毒性和NAC保护机制的认识。这些局限性表明，需要进一步的研究来全面了解吸烟和空气污染的不良影响，以及针对气道中各种环境损伤的受体制定潜在的干预策略。
参考文献
Zheng Y, Tian Q, Yang H, Cai Y, Zhang J, Wu Y, Zhu S, Qiu Z, Lin Y, Hong J, Zhang Y, Dockrell D, Ma S. Identification of Nicotinic Acetylcholine Receptor for N-Acetylcysteine to Rescue Nicotine-induced Injury Using Beating Cilia in Primary Tissue Derived Airway Organoids. Adv Sci (Weinh). 2024 Nov 24:e2407054. doi: 10.1002/advs.202407054. Epub ahead of print. PMID: 39582278.
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