2024年11月，南方医科大学南方医院李刚教授团队在期刊《南方医科大学学报》在线发表题为：[Development of a new platform for testing antiviral drugs using coronavirus-infected human nasal mucosa organoids] 的高水平研究论文。
论文摘要
目的：利用人鼻粘膜类器官建立冠状病毒(CoV)感染模型,并用于药物抗病毒作用体外评价,探讨人类鼻粘膜类器官病毒感染模型用于病毒研究和抗病毒药物开发的可行性。
方法：使用人源鼻粘膜类器官,测试其对SARS-CoV-2和HCoV-OC43假病毒的易感性。在P3实验室中,评估鼻粘膜类器官对SARS-CoV-2原始株及4种变异株的感染情况,优化感染条件。通过荧光定量PCR检测不同时间点培养基中病毒含量,并利用免疫荧光法定位新冠病毒衣壳蛋白,以确定病毒感染细胞的类型。在优化后的鼻粘膜病毒感染模型中,分析已知具有抑制新冠病毒作用的化合物,如卡莫司他和佛手柑素,单因素方差分析推断其在类器官中的抑制效果并预测其机制。
结果：通过培养体系和感染条件的优化,使用SARS-CoV-2不同亚型感染鼻粘膜类器官结果显示2~24h受感染鼻粘膜类器官上清液中的病毒载量明显增加,鼻粘膜类器官可被SARS-CoV-2，HCoV-OC43假病毒感染(P<0.001)。真病毒感染实验证实,SARS-CoV-2原始株及4种变异株,均能稳定感染鼻粘膜类器官,证实病毒感染模型的建立。卡莫司他和佛手柑素,在鼻粘膜类器官中均剂量依赖性抗病毒作用(P<0.0001)。
结论：人鼻粘膜类器官能够作为新冠病毒感染模型,用于抗病毒药物筛选和评价,特别是经鼻腔给药方式的提供了理想的体外研究模型。
创新点
该研究利用人鼻粘膜类器官建立了冠状病毒感染模型，用于体外药物抗病毒作用的评价，这为病毒研究和抗病毒药物开发提供了新的平台。 通过优化培养体系和感染条件，使得SARS-CoV-2不同亚型能够感染鼻粘膜类器官，这为研究病毒在鼻腔内的感染过程提供了更真实的模拟。
研究中分析了已知具有抑制新冠病毒作用的化合物，如卡莫司他和佛手柑素，在鼻粘膜类器官中的剂量依赖性抗病毒作用，这为抗病毒药物筛选提供了新的体外研究模型。
通过分子对接与三维结构模拟，预测了药物抗病毒机制，这种方法有助于理解药物如何作用于病毒，为药物设计和优化提供了理论依据。
该研究提供了一个特别适合经鼻腔给药方式的体外研究模型，这对于开发针对新冠病毒的鼻腔给药抗病毒药物具有重要意义。
文献精读
Q1: 该研究中使用的鼻粘膜类器官模型是如何建立的？
A：从南方医科大学南方医院生物样本库中提取冻存不超过1年的鼻粘膜类器官样本。在无菌条件下将人鼻粘膜组织放入含有1%青霉素和链霉素的4℃预冷HBSS溶液中清洗，并剪切成1mm³的组织块。在37℃下用已修改配制的消化酶消化2小时，然后用100μm细胞过滤器过滤上清液，并以200g离心5分钟。将细胞重新悬浮在培养基中，并与Matrigel以1:1.5（v/v）的比例混合，滴入Transwell板中，加入扩增培养基并每2~3天更换新鲜培养基。使用酶消化法和机械分离法相结合，每培养7天对鼻粘膜类器官进行传代处理，最终形成多个完整的类器官结构。
Q2: 该研究中如何评估药物的抗病毒效果？
A：选择活性良好的鼻粘膜类器官，用Tryple在低温环境下进行类器官消化，待类器官消化至20~30μm的细胞团时终止消化。将Matrigel与培养基按1:1.5的体积比例混合，然后加入细胞悬液，细胞密度保持在1.0×10^5/mL。在96孔板中每孔接种一个20μL的胶滴，转移到37℃的培养箱中，倒置30分钟，以提高类器官的立体性。每孔加入100μL类器官培养基，置于37℃下进行培养，根据细胞生长情况，在传代后的2~3周后，可以将样品带入P3实验室。使用类器官培养基稀释药物，在感染前1小时将维持培养基换为含药物培养基。使用SARS-CoV-2 WT感染鼻粘膜类器官，在胶滴外加入病毒原液，感染2小时后换为含药物的培养基，在37℃培养至感染后4小时收样。弃去胶滴外的培养基，使用500μL的Trizol裂解胶滴，通过qPCR实验检测病毒载量，以评估药物对病毒感染的抑制效果。
Q3: 该研究中提到的卡莫司他和佛手柑素是如何显示出抗病毒效果的？
A：在3μmol/L浓度下，卡莫司他显示出剂量依赖性的抑制SARS-CoV-2感染鼻粘膜类器官的效果；在浓度为0.11μmol/L时，即可达到显著抑制效果。佛手柑素可剂量依赖的抑制SARS-CoV-2在鼻粘膜类器官中的感染，50μmol/L的佛手柑素对SARS-CoV-2的抑制效果显著。分子对接实验显示佛手柑素与卡莫司他均能与人ACE2蛋白有较强的结合能力，跟已知的小分子抑制剂赖诺普利具有相同的结合口袋，其结合能稍弱于赖诺普利，但仍有很好的结合强度。这些结果表明卡莫司他与佛手柑素可能通过结合ACE2蛋白，阻断其与冠状病毒S蛋白结合，从而抑制病毒对鼻粘膜细胞的感染。
结果图
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