舌癌（TC）的复发往往与化疗后残留的少量癌细胞（实体瘤分子残留病灶，MRD）有关。为了深入研究这一现象，日本东京理科大学Toshiaki Ohteki教授领导的研究团队开发了一个舌癌类器官（TCOs）库。这些类器官不仅能够在体外模拟原始舌癌组织的特性，而且在异种移植模型中也展现出相似的生物学行为。研究发现，部分TCOs对顺铂化疗有耐药性，表现出胚胎滞育特征，并激活自噬和胆固醇合成途径。使用特定抑制剂可增强这些TCOs的化疗敏感性，而mTOR抑制剂则可能诱导耐药性。这一模型有助于理解舌癌复发机制，为减少复发提供新策略。
#1
研究背景
Background
舌癌（TC）是最常见的口腔癌类型。手术是治疗TC的首选，高危TC术后进行放化疗。然而，治疗后的复发率很高，复发的TC患者的5年生存率在40%左右。因此，迫切需要制定有效的策略来根除这些耐药TCs。
癌细胞系已被广泛用于临床前人类癌症模型，但从原发癌症组织中建立癌细胞系的效率较低。患者衍生的癌症类器官（PDOs）可以在体外重现患者之间的癌症多样性。然而，TC PDOs（以下简称TCOs）建立的数目很少，且TCOs的细节和TCs的临床多样性尚未被探究。Gu等人的研究表明，多西他赛是一种广泛用于治疗头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的化疗药物，患者源细胞（PDCs）对多西他赛的反应与临床治疗效果一致。然而，PDCs对HNSCC化疗的关键药物顺铂（CDDP）的反应性还没有被评估，化疗耐药产生的机制以及打破化疗耐药的方法也没有被研究。TCs在HNSCC中具有独特的癌变过程和病理特征。在口咽癌中，癌变与人乳头瘤病毒（HPV）感染相关，其预后呈负相关。然而，这种相关性在TCs中不清楚。TCs有较高的复发率和转移率，而且TC切除术极大地降低了患者的生活质量。因此，有必要构建一个大规模的TCO文库，以反映患者与患者之间的癌症多样性，并确定有效的TCs治疗方法。
MRD起源于先前存在的化疗耐药癌症亚克隆或肿瘤亚群，在暴露于化疗药物后短暂获得耐药表型。前一种细胞依赖于基因突变，而后一种细胞是非基因诱导的，被称为“耐药持续细胞”（DTPs）。然而，大多数关于DTPs的研究都是使用有限数量的癌细胞系进行的；因此，目前尚不清楚DTPs在原生肿瘤环境中对MRD形成的贡献有多大，在原生肿瘤环境中，存在患者内部和患者间肿瘤药物反应的异质性。
本研究中，研究人员建立了一个大型的TCO库，概述了28例未经治疗的TC患者的肿瘤组织。根据不同患者对化疗药物的反应，将其分为耐药TCOs和敏感TCOs。这些TCOs的比较分析显示，“可遗传的”胚胎滞育样特征参与了TC耐药MRD的发展。
#2
研究思路
Methods
团队首先使用34名不同年龄和癌症分期的未经治疗的TC患者切除的TC组织建立一个大规模的TCO文库，分析其组织病理学和基因组特征，探究TCOs是否重现原始TC组织的特征；并使用全外显子基因测序（WES）分析确定所建立的TCOs是否保留了相应TC组织的突变谱；又将TCOs原位植入不同小鼠舌头中，研究TCOs在体内的致瘤能力。然后，使用帽分析基因表达（CAGE）和基因本体（GO）分析，确定TCOs的分子特征，并评估患者TCOs的功能异质性，分析TCOs的分化状态与化疗耐药的相关性以及化疗耐药亚克隆的频率与TCOs的化学反应性的相关性。最后，使用不同抑制剂后，用CDDP分别处理化疗耐药TCOs或化学敏感的TCOs，探究胚胎滞育样细胞状态与TCs化疗耐药性的相关性；并将CAGE-seq数据与TCO文库的CDD剂量反应曲线下面积（AUC）值比较，提取与CDDP响应性显著相关的基因，进行GO分析，进一步确定参与化疗耐药的关键途径。
#3
关键研究结果
Results
1、建立TCO库
每个患者来源的TC组织被分成小块，用于组织学分析、外显子组分析、基因表达分析和类器官培养。正常舌组织（TN）也从TCs的边缘区域获得，并与癌组织进行相同的处理。分离的原代TC细胞和TN上皮细胞在10天内生长形成100-200μm大小的类器官。在原代培养中，TNOs的生长速度高于TCOs（P0）。大多数TCOs可稳定维持3个月以上。相比之下，TNOs只能维持一个月，传代两到三次。TP53是人类癌症中最常见的基因突变，包括TCs在内的许多癌症类型中突变型p53积累。肿瘤抑制因子TP53的突变可引起对nutlin-3的耐药性。正如预期，nutin-3治疗后TNOs死亡。然而，来自TP53突变患者（TCO3、TCO12和TCO21）的TCOs对nutin-3有耐药性。这种培养方法也可用于从其他类型的口腔癌中生成类器官，如口腔黏膜癌、口腔底癌和LN-转移的TC。（表1，图1）
表1 患者信息
图1 患者来源的TCs和对应的TN上皮组织的类器官培养
2、TCOs的组织病理学和基因组特征
组织病理学分析结果显示，患者TC组织和TCOs的形态学表现出异质性，患者（P）#3、#8、#12和#18的TC组织和TCOs中终末分化的表面鳞状细胞都很显著，但P#5和#21中没有。对P#3、#5、#12、#18和#21的TC组织和TCOs同样进行p53染色。细胞角蛋白17（CK17）是最近发现的口腔鳞状细胞癌的诊断标志物，因此所有TC组织和TCOs均呈CK17阳性染色。此外，具有代表性的TN组织和TNO显示了鳞状上皮的原始结构，即它们具有多层分层的外观，没有p53或CK17染色，这证实了TCOs由TC细胞组成，而TNOs不含TC细胞。这些分析表明，TCOs准确地反映和再现了原始TCs的异质性。WES结果显示，亲代TC组织中大多数常见的体细胞突变在TCOs中保留，并且其突变谱对每个患者都是独特的。所有不同突变亚型的病例中均发现TP53突变，如P#18有错义突变，P#21有多点错义突变，P#8有多点错义或移码缺失突变，P#25有无义突变。p53的核积累在P#18和#21的TCOs和TC组织中都观察到了，但P#8和#25的组织中没有。这些结果表明，TCOs保留了原发TC组织中存在的突变谱。此外，在COSMIC数据库的Cancer Gene Census Tier1中列出的亲代TC组织中几种癌症相关基因的突变变异通常存在于TCOs中。(图2)
图2 患者来源的TCOs及其原发肿瘤的组织病理学和基因组特征
3、TCOs在体内的致瘤能力
研究人员将TCOs原位植入免疫缺陷Balb/c-nu/nu（裸）小鼠和NOD/Scid/IL2Rγnull（NOG）小鼠的舌头中（图3A）。来自P#3（TCO3）、P#8（TCO8）、P#18（TCO18）、P#21（TCO21）和P#25（TCO25）的5个TCO细胞系在移植后1个月内均成功生长为实体癌。组织学分析表明，类器官来源的TC细胞已进入舌组织。TCO8（高分化至中分化型）而非TCO21（中分化至低分化型）形成或大或小的癌珠巢，中心为癌珠，其分化程度及p53和CK17的染色也反映了原始TC组织的特征。同样，TCO25是一种离体低分化表型，在体内独特地恢复了具有癌珠的分化表型，这与原始TC组织一致。（图3）这些结果表明，TCO系在PDX模型中再现了原始的TC表型。
图3 TCOs移植小鼠PDX模型的组织病理学特征
4、TCOs的基因表达谱
研究人员使用CAGE对8个TCOs和5个TNOs进行了全面的基因表达分析。主成分分析（PCA）图显示TCOs和TNOs的转录组谱之间存在明显的区别。两组之间有1737个差异表达基因（DEGs），其中在TCOs中有1112个基因显著增加2倍以上，625个基因显著减少2倍以上。研究人员又对DEGs进行了GO分析。结果显示，上调的DEGs在“对病毒的防御反应”中富集最为显著，这表明TCOs中干扰素（IFN）信号异常激活。此外，包括许多HOX基因的GO “前/后模式规范”在TCOs中的代表性也过高。同样，HOX基因在人口腔SCC中经常过度表达。下调的DEGs在“细胞迁移的正向调节”以及“伤口愈合”和“细胞粘附”中富集最为显著。在小鼠TC癌变模型衍生的类器官中也观察到类似的结果，表明TC转录组在不同物种之间是一致的。接着，根据TCOs的分化情况将其细分为两组，1组为分化较好的肿瘤组（TCO3、8和18），2组为分化较差的肿瘤组（TCO21和25）。将第1组中表达量显著高于第2组的450个DEGs进行GO分析。在第1组中，排名靠前的GO显著富集的是“细胞粘附”、“细胞外基质组织”和“角化”，这表明在第1组中，上皮分化得到了促进。（图4）总的来说，TCOs在基因表达水平上如实地重现了原发TC组织的特征。
图4 基因表达谱区分TCO和TNO，并重现患者之间的肿瘤变异性
5、患者中的化疗耐药和化疗敏感TCOs
接下来，研究人员评估了患者TCOs的功能异质性，发现其增殖能力和类器官形成效率（OFE）存在显著差异，并根据其OFE对TCO8、25、21、15、12、32、34、3、17和18进行排序。然后，检查了每个TCOs对CDDP化疗的敏感性。根据反映化疗耐药细胞存在的CDDP AUC值，将TCOs按TCO8、21、34、32、25、18、15、12和3排序。由此将TCOs细分为化疗耐药TCO8、21、32和34（红色）和化疗敏感TCO3、12、15、18和25（蓝色）。TCOs的分化状态与化疗耐药的相关性很小或没有相关性。例如，TCO21和25是分化程度较低的类型，但一个是CDDP耐药型，另一个是CDDP敏感型。同样，TCO3、8和18是分化良好的TCOs，但TCO8对CDDP最耐药，TCO3对CDDP最敏感。当TCOs暴露于10 μM CDDP中72小时，化疗耐药TCOs的TC细胞在CDDP停药后重建类器官，而化疗敏感TCOs的细胞则没有。钙黄绿素-AM（活细胞染色）和碘化丙啶（PI，死细胞染色）联合染色显示，有几个但不是所有的耐药TCO8克隆扩增。而且，所有存活的克隆扩增在化学敏感的TCO3中仍然很小。此外，每个TCO的CDDP易感性在重复传代中稳定保持，这表明TCOs存在导致化疗耐药的基因组或表观基因组遗传特征。研究人员收集了CDDP暴露于化疗耐药TCOs后存活的TC细胞，将它们扩增（称为CDDP处理的化疗耐药TCOs），并比较了CDDP对未处理的化疗耐药TCOs的反应性。结果发现，经CDDP处理的化疗耐药TCOs（Tx1和Tx2）的CDDP敏感性与未经CDDP处理的耐药TCOs（Tx0）相当，表明化疗耐药亚克隆的频率并不能决定TCOs的化学反应性。（图5）
图5 化疗药物反应性在患者源性TCOs之间存在差异
6、潜在的胚胎滞育样细胞状态在TCs化疗耐药中的作用
逃避化疗的DTPs的转录组特征与胚胎滞育的转录组特征非常相似，在胚胎滞育中，大多数细胞生物合成和代谢过程基本上被阻止。与化疗敏感的TCOs相比，化疗耐药TCOs中Myc信号通路、蛋白合成、氧化磷酸化、细胞周期相关基因特征、核苷酸代谢的基因特征都被显著抑制。与CDDP暴露前化学敏感的TCOs相比，化疗耐药TCOs中抗氧化途径和自噬等在胚胎滞育和癌症DTP状态下均上调的基因特征显著高于化疗敏感TCOs，这可能会促进细胞活力。与凋亡途径相关的基因特征在耐药TCOs中被显著抑制。为了验证自噬激活是否诱导TC细胞存活，研究人员在一种ULK1抑制剂MRT68921（MRT）存在或不存在的情况下，用CDDP处理化疗耐药TCO8、21和32，可特异性阻断自噬通量。结果发现，这种联合治疗强烈抑制了TCOs的扩增，这表明自噬是化疗应激下耐药化疗TCOs中TC细胞存活的必要条件。为了测试化学敏感的TCOs是否通过阻断mTOR信号反过来获得胚胎滞育样状态，在mTOR抑制剂存在或不存在的情况下，用CDDP处理化学敏感的TCO3和TCO25。结果表明，即使在非常低的浓度（10 nM）下，雷帕霉素或依维莫司也能在化疗敏感的TCOs中人工诱导化疗耐药。（图6）总的来说，胚胎滞育机制的激活，特别是mTOR自噬轴，与TCs的化疗耐药密切相关。
图6 潜伏的胚胎滞育样细胞状态与TCs的化疗耐药有关
7、加速胆固醇生物合成途径是肿瘤耐药的关键
为了进一步确定参与化疗耐药的关键途径，研究人员将CAGE-seq数据与TCO文库的CDDP AUC值进行比较，并提取了与CDDP响应性显著相关的基因。共鉴定出411个与AUC值呈显著正相关的基因。再对这些基因进行GO分析，发现与胆固醇生物合成途径相关的GO是代表性最高的GO。同样，胆固醇合成途径在胚胎滞育期间也被激活。在胆固醇生物合成过程中，乙酰辅酶A通过一系列酶促反应转化为胆固醇。参与胆固醇生物合成的10种酶的基因表达水平与CDDP的AUC值显著正相关。为了验证胆固醇生物合成途径在CDDP抗性中的重要性，研究人员将辛伐他汀添加到CDDP培养中，发现与单独使用CDDP治疗相比，联合用药显著降低了化疗耐药TCOs中TC细胞的存活率，表明抑制胆固醇生物合成途径增强了化疗耐药TC细胞中CDDP的敏感性。（图7）
图7 胆固醇合成的激活促进TC细胞的化疗耐药
小结
本研究建立的独特的TCO文库的比较分析深入了解了MRD形成的分子基础，可能为发现化疗耐药TC细胞的有效药物靶点和生物标志物提供重要资源，并有助于个性化医疗的发展。
然而，在本研究中TNO品系只能维持1个月，2-3次传代。为了解决这个问题，需要通过优化微环境因子（如EGF、RspoI和骨形态发生蛋白（BMP）抑制剂noggin）的浓度和/或添加更多补充剂来改善培养条件，以保持其自我更新能力。
参考文献
Sase M, Sato T, Sato H, Miya F, Zhang S, Haeno H, Kajita M, Noguchi T, Mori Y, Ohteki T. Comparative analysis of tongue cancer organoids among patients identifies the heritable nature of minimal residual disease. Dev Cell. 2024 Nov 2:S1534-5807(24)00607-5. doi: 10.1016/j.devcel.2024.10.007. Epub ahead of print. PMID: 39504967.
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