吉西他滨联合白蛋白紫杉醇（AG）是治疗胰腺导管腺癌（PDAC）的重要选择。然而，对化疗的反应相对较差，耐药发展迅速。最近的一项研究中，天津医科大学郝继辉团队揭示了改善PDAC的化疗耐药新机制，并制定了可使AG方案增敏的策略。该研究结果表明，以AVL9为靶点的药物Edotecarin有望成为提高PDAC对AG敏感性的治疗策略。
#1
研究背景
Background
目前，化疗耐药仍是PDAC治疗面临的最大挑战。近年来，AG已被推荐为PDAC2的标准治疗方案。然而，由于耐药的原因，对AG的反应并不令人满意。因此，探索PDAC的潜在治疗因子以克服化疗耐药是迫切需要的。多项研究表明AVL9可促进多种肿瘤的进展，但AVL9在PDAC中的作用尚未被探索。在这里，研究人员研究了AVL9在胰腺癌化疗耐药中的作用。发现肿瘤缺氧微环境导致AVL9表达升高，进而促进IκBα的降解和NF-κB的异常激活，从而增强肿瘤细胞的抗凋亡能力。此外，通过筛选抑制剂，为消除AG的化疗耐药性提供了一种有前景的靶向AVL9的药物。
#2
研究思路
Methods
研究人员使用了类器官模型、患者来源的异种移植（PDX）和基因工程小鼠模型，采用染色质免疫共沉淀、双荧光素酶实验、免疫共沉淀和western blot分析探讨其作用机制。通过蛋白结构分析和分子对接分析鉴定AVL9抑制剂，并在PDX、PDOX和KPC模型中验证其疗效。通过多策略筛选，研究人员发现AVL9是PDAC中AG耐药的关键靶点。在机制上，缺氧相关转录因子HIF-1α驱动AVL9的表达，AVL9可作为支架促进IκBα与SKP1结合，增强IκBα的泛素化和降解，进一步激活NF-κB通路。潜在的AVL9靶向抑制剂Edotecarin被证明可以逆转PDAC中的AG化疗耐药性。在PDAC中，AVL9的表达由HIF1α驱动。AVL9、IκBα和SKP1的物理相互作用为NF-κB通路的异常激活提供了新的分子机制。
#3
研究结果
Results
1. AVL9被确定为胰腺癌化疗反应的潜在靶点
研究人员使用四个独立的数据集创建了一个四步筛选策略：来自对AG有不同应答的晚期PDAC患者的PDOs、PDXs、细针穿刺（FNA）的RNA-seq数据，以及来自原发性PDAC的单细胞RNA-seq数据（CRA001160）。
在步骤1中，10例接受了全外显子组和转录组测序的患者的器官组织接受了AG治疗，然后使用细胞滴度Glo测定分析IC50值以评估其化疗反应。根据来自AG方案的IC50值将器官组织分为两组：敏感组（PDO1#-5#）和耐药组（PDO6#-10#），并对敏感组和耐药组的类器官进行了DEGs分析。第二步，对来自6例PDAC患者的体内PDXs进行AG处理。采用基于HE染色的肿瘤消退评分（TRG）评估其化疗反应，将TRG评分为1-2-3分的PDXs定义为敏感组，4 ~ 5分的PDXs定义为抵抗组，并进行了DEGs分析。第三步，6例PDAC患者接受2个周期AG方案新辅助化疗。对切除的肿瘤进行TRG评分，根据评分将这些类器官分为两组：敏感组（PDAC1#-3#）和抵抗组（PDAC4#-6#），并对FNA获得的原发性PDAC标本进行RNA测序，然后确定敏感组和耐药组之间的DEGs。第四步，从PDAC原发灶和癌旁组织中获取单细胞RNA-seq数据（CRA001160）进行降维，然后分析正常和恶性导管细胞之间的DEGs。
最后，对四个数据集的DEGs进行识别，取交集。对表达量增加的前10个基因进行评估，AVL9被确定为在PDAC中与AG耐药和生存预后相关的最具差异的过表达基因。此外，使用单细胞RNA测序数据（CRA001160）确认了其表达模式。在其他公共数据集中（GSE28735，GSE62452，GSE71729）也证实了AVL9在PDAC肿瘤组织中的表达增加（图1）。基于这些实验研究和生物信息学分析，研究人员确定AVL9是改善PDAC中AG耐受性的潜在靶点。
图1 AVL9被确定为胰腺癌化疗反应的潜在靶点
2. AVL9在胰腺导管腺癌中的表达及其临床意义
研究人员收集了肿瘤和癌旁组织，检测AVL9在PDAC中的表达，发现AVL9在肿瘤中过表达，并且在64对肿瘤中有较高水平，这被TCGA数据证实。此外，AVL9低表达患者的总生存期和无复发生存期较长。在两个队列中进一步验证发现，AVL9高表达与接受AG方案新辅助化疗的患者早期肝转移和无进展生存期下降相关。此外，与AVL9-low组相比，AG在AVL9-high组中的IC50值显著较高。研究人员使用随机选取的6例患者的手术肿瘤组织构建PDX模型，根据AVL9的表达水平将其分为两组，发现与AVL9-low组相比，AVL9-high组的肿瘤重量抑制显著降低（图2）。结果表明AVL9的高表达与PDAC患者的不良预后和化疗耐药相关。
图2 AVL9在胰腺导管腺癌中的表达及其临床意义
3. 肿瘤AVL9在体内外促进PDAC的化疗耐药
通过评估AVL9在原代细胞系中的表达和创建稳定细胞系，研究人员在低、中表达水平的细胞系中过表达AVL9，在中、高表达水平的细胞系中下调AVL9的表达。发现过表达AVL9增加了AG的IC50，而敲除AVL9则降低了该值。在AG缺失的情况下，AVL9的异位表达不影响肿瘤细胞的增殖或凋亡。然而，在AG处理过程中，它降低了细胞凋亡率，而敲低AVL9导致细胞凋亡增加。AVL9在正常条件下对细胞生长的影响最小，但在AG治疗期间提高了细胞存活率。在正常条件下，AVL9不改变DNA损伤或凋亡相关蛋白，但在AG处理下敲低AVL9导致γ-H2X和Cleaved-Caspase3水平升高。为了进一步研究AVL9是否可以解释PDAC在体内的化疗反应，研究人员构建了KPC小鼠AVL9纯合缺失（KPCA）。出生2个月后，将KPC和KPCA小鼠随机分为两组：vehicle组和AG组。检测发现，经AG处理后，KPCA的肿瘤负荷明显低于KPC。此外，研究人员发现经AG处理后，KPCA小鼠中cleaved-caspase3标记的肿瘤凋亡显著增加。在一项平行的生存试验中，研究人员在接受AG治疗的KPCA小鼠中观察到显著的生存获益（图3）。综上所述，体内外实验结果提示肿瘤AVL9促进了PDAC的化疗耐药。
图3 肿瘤AVL9在体内外促进PDAC的化疗耐药
4. 缺氧相关转录因子HIF-1α驱动PDAC中AVL9的表达
研究人员对4例患者的新鲜肿瘤组织进行了scRNA-seq，分析了24,410个细胞，发现HIF1α的特异性表达与AVL9的阳性相关。检测发现AVL9和HIF1α mRNA水平之间存在强的正相关关系，并且在肿瘤组织中存在正的IHC相关性。低氧条件下HIF-1α和AVL9的mRNA和蛋白水平均升高。用HIF-1α抑制剂KC7F2处理后，AVL9的表达显著降低。计算分析显示在AVL9启动子处有一个强有力的缺氧反应元件（HRE）。染色质pull-down实验显示HIF-1α与AVL9启动子结合。荧光素酶实验也证实HIF1-1α增加了AVL9启动子的活性。因此，在PDAC中，以其在缺氧中的作用而闻名的HIF-1α很可能调节了AVL9的表达。分析胰腺导管腺癌组织中AVL9的表达和乳酸水平，以确定乳酸对AVL9表达的影响，结果显示AVL9评分与乳酸含量呈正相关。在癌细胞培养物中添加25 mM乳酸，随着时间的推移，AVL9 mRNA水平增加，并提高总泛乳糖基赖氨酸（Kla）的表达。研究人员还研究了组蛋白的乳糖化是否促进AVL9的表达，发现乳酸处理增加了AVL9和H3K18la的水平。靶向乳酸转运蛋白的抑制剂AR-C155858显著降低了AVL9和H3K18la的表达。抗H3K18la抗体的ChIP显示，H3K18la在AVL9启动子区域富集（图4）。这些发现表明，TME中缺氧相关的乳酸蓄积通过H3K18la诱导AVL9表达。
图4 低氧环境可促进PDAC中AVL9的表达
5. AVL9通过诱导IκBα泛素化蛋白酶体降解和P6核转位增强PDAC的化疗耐药
为了研究AVL9如何增强胰腺癌细胞的化疗耐药性，研究人员对PDX-vector/AVL9-OE细胞系进行了RNA-seq和GSEA分析。值得注意的是，NF-κB信号通路在AVL9-OE细胞中高度富集，AVL9过表达可增强P65的核转位，但不影响IKKβ、IκBα或P65的磷酸化。此外，AVL9在不影响IκBα mRNA水平的情况下降低了IκBα蛋白水平，表明在翻译调节中起作用。CHX处理证实AVL9促进IκBα降解，MG132处理逆转了AVL9对IκBα稳定性的影响。AVL9还增加了IκBα泛素化水平，IκBα-KO实验表明，AVL9可以抵消AVL9的化疗耐药效应（图5）。综上所述，AVL9通过促进IκBα泛素化和促进P65核转位增加PDAC的化疗耐药性。
图5 AVL9通过诱导IκBα的泛素化-蛋白酶体降解和P65的核转位增强PDAC的化疗耐药性
6. AVL9促进IκBα与SKP1结合，从而介导IκBα在PDAC中的泛素化-蛋白酶体降解
已知IKK1和IKK2介导IκB降解和NFκB修饰。然而，AVL9不影响IKKβ、IκBα和P65的磷酸化水平，表明在高AVL9水平的PDAC中，IκB的降解可能独立于IKK发生。为了验证假设，研究人员使用CRISPR/Cas9技术构建了ikkβ缺陷的PDX细胞系。然后用AVL9-OE或shAVL9质粒转染这些细胞系，发现AVL9通过一种不依赖于IKKβ的机制促进IκBα的降解并促进PDAC的化疗耐药。为了探究AVL9在调控IκBα稳定性中的作用，研究人员通过亲和纯化和质谱分析与AVL9相互作用的蛋白。免疫共沉淀实验显示，在PDX细胞系中，Flag-AVL9与MYC-IκBα共沉淀，MYC-IκBα也可与Flag-AVL9共沉淀。此外，研究人员观察到了内源性相互作用。研究人员还发现AVL9与SKP1相互作用，并直接与SKP1和IκBα结合。MG132处理增加了SKP1与IκBα的结合，敲低SKP1抑制了AVL9介导的IκBα的降解，表明AVL9通过促进IκBα与SKP1的结合来增强IκBα的降解。为了确定结合区域，截断研究发现AVL9-Domain4（aa 380-600）和SKP1-Domain3（aa 114-145），以及AVL9-Domain4和IκBα-Domain3（aa 182-211）有相互作用。体外实验证实，敲除AVL9的关键结构域（aa 380-600）可消除其化疗耐药作用（图6）。这些发现为精确靶向AVL9以克服PDAC的化疗耐受性提供了新的见解。
图6 AVL9促进IκBα与SKP1的结合
7. 分子对接分析发现，Edotecarin可干扰AVL9与SKP1的相互作用，从而增加PDAC对AG方案的敏感性
考虑到AVL9-SKP1复合体在PDAC化疗耐药中的重要作用，通过分子对接分析筛选干扰AVL9与SKP1相互作用的潜在抑制剂。AVL9和SKP1相互作用位点的几个候选配体被确定。其中，拓扑异构酶I抑制剂Edotecarin的亲和力得分最高。免疫共沉淀验证了Edotecarin可以显著取消SKP1和AVL9之间的物理相互作用。接下来，研究人员使用SynergyFinder2.0在PDO模型中分析了Edotecarin和GEM的联合作用。Edotecarin与GEM的综合协同评分表明，在测试的浓度范围内，Edotecarin和GEM表现出协同的细胞毒性作用。此外，AG联合Edotecarin可以明显诱导凋亡标志物（Caspase3/7）的表达。与KPCAVL9-WT组相比，AG能显著抑制KPCAVL9-KO组的胰腺肿瘤负荷，而Edotecarin能显著消除这种差异。胰腺肿瘤的Cleaved-Caspase3染色也显示了类似的结果。在平行生存试验中，KPCAVL9-KO组可以从AG中获得比KPCAVL9-WT组更多的生存获益，而KPCAVL9-KO组在AG+ Edotecarin处理后未能获得更长的生存时间。在体内，研究人员使用了几种临床前小鼠模型，包括PDOX、PDX和KPC。将荧光素酶标记的PDO原位移植到裸鼠体内，并随机分为4组。检测发现与单药治疗相比，联合治疗显著降低了肿瘤负荷。此外，Edotecarin和AG的联合使用导致了更高的肿瘤细胞凋亡率。更重要的是，联合用药组患者的生存时间更长（图7）。以上证据表明，在临床前小鼠模型中，Edotecarin可使PDAC对AG增敏。
图7 分子对接分析发现，Edotecarin可干扰AVL9与SKP1的相互作用，从而增加PDAC对AG方案的敏感性
小结
该研究证实了AVL9为胰腺癌化疗反应的潜在靶点，机制方面，研究人员发现NF-κB通路与AVL9的表达呈正相关。进一步的体外实验证明AVL9可通过促进P65核转位和激活NF-κB通路诱导AG耐药，而IκBα的降解是P65核转位的关键步骤。此外，AVL9依赖于SKP1促进IκBα降解。分子对接分析发现，Edotecarin可干扰AVL9与SKP1的相互作用，从而增加PDAC对AG方案的敏感性。
参考文献
Ding, J., et al., Hypoxic and acidic tumor microenvironment-driven AVL9 promotes chemoresistance of pancreatic ductal adenocarcinoma via the AVL9-IκBα-SKP1 complex. Gastroenterology, 2024. DOI: 10.1053/j.gastro.2024.10.042.
“
”
添加客服小助理，获取原文PDF
往期推荐
Nature | 首次将血管类器官应用于模拟糖尿病血管病变疾病
心脏类器官项目获省自然攀登立项！最新高分综述全面解析心血管类器官研究进展
Cell Stem Cell | 利用【脊髓类器官】模型，阐明脊髓发育早期微环境对神经再生的作用
重磅推荐！首次建立基于类器官的药敏试验在肿瘤精准医疗和药物开发中的应用共识
