Nature顶刊 |目前最大规模的人类神经类器官的整合转录组细胞图谱的整合分析

人类神经类器官是由体外多能干细胞产生的，是研究人类大脑发育、进化和疾病的有用工具。然而，目前尚不清楚人类大脑的哪些部分被现有的方案所覆盖，且很难定量评估类器官的变异和保真度。该研究将跨越26个方案的36个单细胞转录组数据集整合到一个集成的人类神经类器官细胞图谱中，总计超过170万个细胞。映射到发育中的人脑参考图谱显示了体外产生的原代细胞类型和状态，并估计了不同方案中原代和类器官对应物之间的转录组相似性。还提供了一个程序化的界面来浏览图谱和查询新的数据集，并展示了图谱在注释类器官细胞类型和评估新的类器官方案方面的强大功能。最后研究表明图谱可以作为一个不同的对照队列来注释和比较神经疾病的类器官模型，识别可能与神经模型的病理机制相关的基因和途径。人类神经类器官细胞图谱将有助于评估类器官保真度，表征紊乱和病变状态，并促进方案的制定。

人类神经类器官是体外培养的自组织三维人类神经组织，正在成为研究人类大脑发育、进化和疾病机制的有力工具。它们可以使用外部模式因子来引导它们向特定大脑区域发育或驱动特定细胞类型的出现。相反，无引导的方案依赖于类器官的自我模式能力来产生不同的细胞类型和状态。单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种表征复杂组织中细胞类型异质性的强大技术，揭示了神经类器官中多种祖细胞、神经元和胶质细胞类型的显著异质性，以及某些神经谱系的分化轨迹。这些数据还可以将人类神经类器官细胞与初级人类大脑中的细胞进行比较，大多数分析都揭示了分子特征的高度相似性。还报道了显著差异，包括与培养基成分相关的差异基因表达和与糖酵解相关的代谢特征紊乱。尽管如此，对类器官组织的分析支持了对早期大脑发育的有用概括，scRNA-seq方法已被应用于研究神经细胞类型命运决定的分子基础、灵长类动物的进化差异和神经疾病的病理变化。然而，目前尚不清楚哪些发育中的中枢神经系统部分可以用现有的方案生成，哪些仍然缺乏。因此，系统地量化神经类器官细胞的转录组保真度仍然具有挑战性。

这项研究将36个scRNA-seq结合到一个整合的转录组细胞图谱中来解决这些挑战，这些数据集涵盖了许多人类神经类器官协议。通过建立一个分析管道可以全面和定量比较类器官图谱和发育中的人脑图谱，协调了原代和类器官系统中细胞群的注释，估计了不同神经类器官方案产生不同大脑区域的能力和精度，并确定了在类神经器官中代表性不足的原代细胞群。该研究估计了神经类器官中神经元的转录组保真度，并确定了先前描述的细胞应激是区分体外神经元与原代神经元代谢状态的一个普遍因素，而不会强烈影响神经元细胞类型的核心特性。我们将神经类器官形态发生筛选的数据映射到综合图谱中，以评估区域特异性和新状态的产生。还收集11个scRNA-seq数据集，以建模10种不同的神经疾病，并将整合的数据映射到神经类器官图谱中，用于细胞类型注释和差异表达（DE）分析。最后证明可以通过将新数据投影到当前地图集来扩展地图集。综上，该工作提供了丰富的资源和一个新的框架来评估神经类器官的保真度，表征紊乱和病变状态，简化方案的制定。

1. HNOCA构建：数据管理、协调和集成；

2. HNOCA与与人类大脑发育参考图谱对比、转录组保真度分析；

3. HNOCA应用于构建神经相关疾病模型。

1、数据管理、协调和集成

为了构建HNOCA，收集来自36个数据集的scRNA-seq数据和详细的、统一的技术和生物元数据，其中包括34个已发表的数据集和2个尚未发表的数据集，经过一致的预处理和质量控制，共计177万个细胞。HNOCA代表了26种不同的神经类器官分化方案（包括3种非引导和23种引导）在7 - 450天的时间点上产生的细胞类型和状态。UMAP嵌入突出了三种神经元分化轨迹，分别对应于背端脑、腹端脑和非端脑群体，以及从祖细胞到胶质细胞类型（如星形胶质细胞和少突胶质细胞前体）的轨迹。来自非引导和引导方案的细胞分布在所有轨迹上。为了阐明细胞状态和类型的动态和转变，使用moscot在神经最优运输的基础上重建了HNOCA细胞的实时通知伪时间。聚焦于背端脑端神经轨迹，观察到SoX2（神经祖细胞NPCs）、BCL11B（深层皮层神经元）和SATB2（上层皮层神经元）等标记基因的一致伪时间表达谱。为了进一步解决非端脑神经元之间的异质性，对该群体进行了亚聚类，揭示了许多具有不同标记基因表达特征的神经元群体（图1）。

图1

2、HNOCA投影到人类发育中的大脑图谱

为了评估细胞类型注释，并更精确地注释异质性的非端脑神经元群，将HNOCA与最近发表的发育中的人脑单细胞转录组图谱进行了比较。转移的标签与该研究分配的标签高度一致，使能够细化HNOCA非端脑NPCs和神经元的区域注释，以及非端脑神经元的NTT注释，从而得到最终的分层HNOCA细胞类型注释。将类器官细胞与人类大脑发育的早期阶段进行比较，从妊娠早期观察到的细胞状态到妊娠中期观察到的更成熟状态的转变，并且没有发现与后期的实质性匹配。此外，还评估了每种神经类器官生成不同脑区神经细胞的能力。通过将每个类器官数据集的分数归一化，获得了一个指标来描述每种原代细胞类型在至少一个HNOCA数据集中的表现情况。该分析证实了HNOCA中红细胞、免疫细胞和血管内皮细胞的缺失，这些细胞均来源于非神经外胚层。正如预期的那样，端脑细胞类型在HNOCA中最具代表性。相比之下，丘脑、中脑和小脑的细胞类型最少，包括丘脑网状核GABA能神经元、中脑背侧m1来源的GABA能神经元和m1/m2来源的谷氨酸能神经元以及小脑Purkinje细胞（图2）。

图2

3、转录组保真度类器官细胞类型

接下来，鉴定了差异表达基因（DEGs），并将HNOCA中的神经细胞类型与其主要对应的神经细胞类型进行了比较。对于大多数神经细胞类型，超过三分之一（平均34.4%，标准差12.1%）的DEGs在至少一半的方案中是共享的，这表明类器官细胞和原代细胞之间的许多转录组差异与类器官方案无关。还评估了跨区域神经细胞类型共享的差异转录组程序，并确定了总共920个普遍存在的、协议通用的DEGs (u DEGs，这些DEGs在16种神经细胞类型中的至少14种中差异表达。这些uDEGs在神经元类型和协议中显示出一致的折叠变化（r> 0.8），并且无论协议或神经元细胞类型如何，都代表了类器官神经元和原代组织中神经元之间一致的分子差异。在所有920个uDEGs中，363个基因持续上调，673个基因持续下调，只有59个基因（6%）在亚型或协议中不一致地表达差异。通过对uDEGs进行基因本体富集分析，发现下调的uDEGs富集于神经发育过程中，包括神经元细胞-细胞粘附和突触组织。上调的uDEGs在许多代谢相关术语中富集，包括线粒体ATP合成耦合电子传递（简称电子传递）和典型糖酵解。在HNOCA和原始参考图谱中对线粒体电子传递、典型糖酵解和标志性糖酵解基因集进行评分，发现这三个术语都显示了类器官细胞和原代细胞的显著分离。此外，该研究观察到脑区域依赖性的转录组相似性差异。例如，来自大多数脑区的背侧部分的类器官神经元与来自大多数脑区的腹侧部分的细胞类型在类器官数据集中表现出更高的相似性（图3）。

图3

4、HNOCA促进类器官方案评估

从最近发表的多路神经类器官形态发生筛选中检索了scRNA-seq数据，并将其投影到HNOCA和主要参考潜在空间中。通过转移了区域标签，发现与提供的区域标注高度一致，但在前脑、中脑和后脑的每个宽脑切片中分辨率更高。因此，转移的注释允许更全面地评估不同形态发生条件对生成不同脑区神经元的影响。进一步计算参考细胞在每种筛选条件下的存在分数，并将不同筛选条件下的数据与36个HNOCA数据集进行比较。对平均在场得分使用分层聚类揭示了许多屏幕条件下不同的在场得分概况。接下来，总结了整个形态原筛选数据的最大存在分数，并将其与HNOCA数据进行比较，以确定在筛选中存在增加的主要参考细胞类型。该分析突出了在特定筛选条件下丰度显著增加的几个参考细胞簇，如腹侧端脑的LHX6/ACKR3/MPPED1三阳性GABA能神经元和腹侧中脑的多巴胺能神经元。综上所述，将形态学筛选查询数据投射到HNOCA和主要参考文献中，可以对形态学筛选数据进行精细注释，并对新的分化方案的价值进行全面和定量的评估，以产生以前在神经类器官中未被充分代表或缺乏的神经元细胞类型（图4）。

图4

5、HNOCA有助于疾病模型的解释

接下来，测试了整合的HNOCA是否可以作为评估神经疾病类器官模型的对照队列。收集了来自10个神经类器官疾病模型和相应对照的11个scRNA-seq数据集。将数据投影到HNOCA和主要参考图集中以传输注释，发现在大多数研究中，疾病模型类器官与各自的研究特异性对照类器官之间的细胞类型和脑区域组成存在差异。该研究开发了一种基于wkNN的策略，为每个疾病模型类器官scRNA-seq数据集中的每个细胞生成匹配的HNOCA元细胞），并量化了它们的转录组相似性。胶质母细胞瘤类器官数据集显示，与其他疾病模型相比，它们与主要对应器官的相似性明显较低。为了评估这些转录组差异，在胶质母细胞瘤和匹配的对照元细胞之间进行了DE分析。聚焦于AQP4+群体，在胶质母细胞瘤细胞中发现了1951个DEGs，与匹配的HNOCA元细胞相比，发现RBM25 CALD1、HNRNPU7和SPARC68等基因的表达增加，所有这些基因都被报道与胶质母细胞瘤相关。接下来，重点研究了FXS的类器官模型，其中对照类器官中的NPCs和神经元具有非端脑的特性，而疾病模型类器官主要包含端脑细胞（图5）。

图5

6、通过数据投影扩展HNOCA

新的人类神经类器官scRNA-seq数据集不断产生，利用这些额外的数据不断扩展和更新HNOCA将具有重要意义。因此建立了一个计算工具包，将新的scRNA-seq数据投射到HNOCA。使用基于wkNN的标签转移来协调细胞类型注释，并将细胞置于现有的类器官单细胞转录组环境中，如HNOCA所示。使用本研究方法将进一步的数据集映射到HNOCA，通过增加现有神经类器官协议和类器官中生成的神经细胞类型的覆盖范围，增强了图谱。为了使研究人员能够在自己的分析中使用HNOCA，提供了各种探索和与地图集交互的选项（图6）。

图6

该研究展示了HNOCA如何通过将神经类器官的额外单细胞转录组数据投射到图谱中来扩展和更新。此外，该研究开发了一个计算工具包，HNOCA工具，这将使其他研究人员能够概括我们研究中应用的分析框架。总之，HNOCA将保持最新状态，并继续反映体外类器官中产生的人类神经细胞状态的景观，作为神经类器官群落的生活资源，能够评估类器官保真度，表征紊乱和病变状态以及制定新方案。

参考文献

He Z, Dony L, Fleck JS, Szałata A, Li KX, Slišković I, Lin HC, Santel M, Atamian A, Quadrato G, Sun J, Pașca SP; Human Cell Atlas Organoid Biological Network; Camp JG, Theis FJ, Treutlein B. An integrated transcriptomic cell atlas of human neural organoids. Nature. 2024 Nov;635(8039):690-698. doi: 10.1038/s41586-024-08172-8. Epub 2024 Nov 20. PMID: 39567792; PMCID: PMC11578878.