在医学研究的前沿，一项突破性技术正在悄悄改变我们对疾病治疗的看法。这不仅仅是关于新药的发现，而是关于重新定义我们如何模拟和修复人体最复杂系统的方法。这就是类器官技术——利用干细胞在体外培育出具有真实器官结构和功能的“迷你器官”。这些微小的结构不仅为我们提供了研究疾病的新窗口，还开辟了个性化医疗的新途径。本文将和大家一起深入了解类器官的奥秘以及它们释放的细胞外囊泡如何成为治疗复杂疾病的新希望。
#1
研究背景
Background
生物医学研究急需模拟人体组织和器官、构建疾病模型以及开发新疗法。干细胞技术的进步带来了类器官技术，它提供了一种新的体外模型系统，能够模拟组织的结构和功能。类器官是由干细胞在三维培养条件下形成的，能够复制源组织的生物学特性，为研究组织生长、疾病进展和药物筛选开辟了新途径。此外，类器官衍生的细胞外囊泡（OEV）因其丰富的生物活性分子和低免疫原性，在医学应用中显示出巨大潜力。
在类器官技术之前，2D细胞培养和动物模型是研究细胞和疾病的主要手段。然而，2D培养无法模拟组织的立体结构和生理行为，动物模型存在种属差异和伦理问题，限制了对人类疾病的准确研究和新药测试。因此，寻找新的研究模型和技术成为生物医学领域的重要挑战。
本综述探讨了类器官和OEV在疾病治疗中的潜力，并讨论了它们在现代医学研究中的应用前景。通过概述类器官和OEV的生物学原理、在疾病治疗中的应用、与传统EV的区别以及OEV的工程化改造方法，旨在深化对这些技术的理解，展示类器官和OEV如何为复杂疾病提供创新解决方案，推动个性化和再生医学的发展。通过分析这些技术的优势和挑战，激发进一步的研究和探索，实现类器官和OEV在临床治疗中的应用。
图1
#2
研究结果
Results
1. 类器官概述
类器官是体外培养的三维细胞结构，能模拟真实器官的空间结构和功能。它们可由胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（iPSC）和成体干细胞（ASC）形成。ASC分化潜力有限，主要产生单一功能类器官，而iPSC和ESC能分化成多种细胞类型，形成结构复杂、功能多样的类器官，适合基础研究和药物筛选。类器官技术旨在构建具有多重生理功能的类器官，以提高治疗效果，但目前研究尚处早期阶段，类器官功能相对单一。
1.1 用于疾病治疗的类器官
1.1.1 骨缺损的类器官
Wang等人开发了一种新型生物墨水，通过3D打印模拟骨组织结构，促进成骨细胞矿化。该材料在体外和体内均显示出促进骨形成的能力，通过激活成骨相关信号通路，增加成骨标志物的表达。Ouyang团队则利用数字光处理技术构建骨痂类器官，模拟软骨内成骨过程，加速原位骨再生（图2A、B）。
1.1.2 类器官治疗IBD
炎症性肠病（IBD）是一种自身免疫性疾病，目前缺乏有效治疗手段，通常依赖药物或手术控制病情。Shiro Yui等研究者通过使用肠隐窝Lgr5干细胞构建结肠类器官，并将其移植到IBD小鼠模型中，成功减轻了疾病严重程度。移植的类器官与患病区域融合，并改善了细胞增殖、粘液分泌和肠道代谢。2022年，东京医科和牙科大学实现了世界上首例使用肠道类器官治疗IBD的临床应用，患者恢复良好，但需进一步随访以评估长期效果。该大学还计划进行临床试验，评估自体肠上皮干细胞移植治疗难治性溃疡性结肠炎的安全性（图2C）。
1.1.3 神经修复类器官
创伤性脑损伤（TBI）后，成年哺乳动物大脑的神经发生和轴突再生能力有限，导致长期神经损伤。细胞移植被认为是恢复大脑功能的有效方法。研究表明，将胎鼠皮质移植到成年鼠大脑中能刺激神经元突生长，并与宿主大脑整合，显示了重建神经元网络的潜力。基于此，脑类器官因其能复制脑细胞类型和结构的多样性，被用于研究。Jgamadze等人将前脑类器官移植到损伤的成年大鼠视觉皮层，发现移植物与宿主皮层整合，并表现出自发神经活动，证实了类器官在TBI治疗中的潜力（图2D）。
图2
1.1.4 胆管病类器官
Sampaziotis等人的研究通过单细胞RNA测序分析了胆道树不同区域的细胞，发现尽管它们共享核心转录谱，而来自不同区域的胆管细胞则表现出独特的基因表达特征。当这些细胞被培养成类器官后，它们在转录特征上的差异消失，显示出高度的可塑性。实验中，将这些类器官移植到胆管病小鼠模型中，显著延长了小鼠的存活期，并在再生胆管上皮中占据了相当比例，且未引起异常生长或肿瘤形成，证明了类器官移植在修复胆道损伤中的潜力。
类器官技术作为一种新兴的治疗工具，在生物医学研究和临床应用中展现出巨大潜力。它们能够模拟器官的关键特征，为疾病建模、治疗测试提供动态平台。例如，武部团队通过油酸处理肝类器官成功创建了脂肪肝疾病模型，推进了非酒精性脂肪性肝炎的研究。兰开斯特的研究小组开发了包含神经组织和成熟大脑结构的脑类器官，为研究人体组织和器官发育提供了重要工具。这些进展不仅展示了类器官技术在重建复杂疾病环境中的应用，也为代谢和肝脏相关疾病的药物测试和个性化医学方法开辟了新途径。随着类器官技术的不断发展，它有望弥合临床前研究和人体临床试验之间的差距，最终实现在临床环境中的应用，为器官移植、组织再生和慢性疾病治疗提供新解决方案，推动个性化和再生医学的发展（图3）。
图3
2. OEV概述
类器官分泌的OEV（类器官细胞外囊泡）在细胞间信息交换和物质运输中扮演关键角色，类似于传统2D细胞分泌的EV（细胞外囊泡）。OEV含有多种生物活性物质，能调节靶细胞的基因表达和功能。尽管OEV和EV都属于哺乳动物细胞外囊泡（MEV），具有相似的生物发生和内化机制，但类器官的三维结构和细胞多样性使得OEV与传统EV存在差异。OEV更接近体内环境，模拟复杂的细胞相互作用。
2.1 OEV的生物发生、结构、组成和内化
OEV包含微囊泡、外泌体和凋亡小体三种亚型，其中外泌体因其生物学功能和应用潜力而研究较多。OEV是纳米级囊泡，通过质膜双重内陷分泌到细胞外，其生物发生包括形成早期内体、多泡体（MVB）成熟和ILV释放为OEV。OEV通过膜融合或胞吞作用（如网格蛋白介导和小窝蛋白依赖途径）将生物活性物质转运到其他细胞，促进细胞间通信（图3、4）。
2.2 OEV的分离
类器官的培养复杂性使OEV的分离具有挑战，因为三维支架如Matrigel中的蛋白质可能干扰分离过程。与传统细胞系相比，OEV的分离需要更精细的处理以保护囊泡的纯度和功能。常用的分离方法包括差速离心、密度梯度离心、超滤和免疫亲和捕获等。团队开发了一种适用于多种细菌的BEV分离方法，并建立了新的OEV提取方案，强调使用无外源EV的培养基以避免污染。提取过程包括更换培养基、收集器官条件培养基、低速离心、过滤和超滤，以及两轮超离心分离OEV。分离的OEV在特性上与传统EV不同，类器官中多种细胞类型的存在使得OEV在类型和功能上更加复杂。因此，进行特定分析时需要考虑OEV的细胞来源多样性，并优化检测方法以确保结果的准确性和科学有效性（图4、表1）。
图4
表1
2.3 OEV和EV的区别
类器官与传统细胞培养的主要区别在于结构的三维性。3D环境中的细胞展现出比2D环境中更复杂的通信模式，这种增加的复杂性也提升了OEV的复杂性。研究表明，3D培养的人间充质干细胞（hMSC）分泌的OEV在产量和CD63表达上更高，且具有更强的生物学功能，如促进神经再生和治疗阿尔茨海默病。3D培养的MSC分泌的外泌体在心脏修复中显示出比2D培养的更强的心脏保护作用。此外，3D培养的MSC分泌组能促进角膜创面愈合，表明3D培养系统能增强分泌组，优化细胞培养环境。这些发现表明，3D培养条件下的细胞具有更自然的生理结构，分泌的OEV在数量和载货特性上可能更接近体内环境，具有更高的产量和更好的生物功能。与3D细胞培养相比，类器官不仅增加了细胞间接触面积，还丰富了细胞亚型多样性，增加了细胞间通讯的复杂性，预计OEV的复杂性将超过3D培养的外泌体。
3. OEV的应用
OEV作为一种无细胞系统，能有效递送活性物质，参与细胞间通讯，具有治疗潜力和作为药物载体的优势。
3.1 肠道OEV用于免疫调节
研究表明，多种来源的EV具有免疫调节能力，如肠上皮来源的EV能调节Treg细胞，肠道类器官分泌的OEV能减少LPS诱导的炎症因子产生。吗啡干预后，OEV的免疫调节能力丧失，分析发现多种microRNA，尤其是let 7，是OEV免疫调节能力的关键成分，let 7在炎症控制中起关键作用（图5A）。
3.2 唾液腺OEV用于上皮修复
Ferreira等人开发的磁性3D生物组装（M3DB）平台能够安全、无创地培养带有磁性纳米颗粒标记的hDPSC，并构建功能性唾液腺类器官（SGo）。这些SGo表达唾液腺特异性标记，证实了M3DB平台的有效性。研究中提取的3D-hDPSC-EVs和SGo-OEVs在上皮损伤模型中显示出修复能力，其中SGo-OEV的效果最佳，达到60%，超过了直接SGo移植的25%和3D-hDPSC-EVs的15%。蛋白质组学分析揭示SGo-OEV中有99种特异性蛋白异常表达，涉及生物调控、粘附等多个关键生物过程，表明OEV的生物功能优于3D-EVs，其治疗效果甚至超过了直接SGo移植，这为OEV和类器官在疾病治疗中的潜力提供了新的见解（图5B）。
3.3 视网膜类器官OEV用于视网膜变性修复
利用hESC体外生成的视网膜类器官（hERO）和表达CD29的Müller胶质细胞，移植到视网膜神经节细胞小鼠后部分恢复视觉功能。这些神经胶质细胞可能通过释放OEV控制神经元凋亡和存活，从而发挥神经保护作用。Xu研究组构建了hERO并提取hESC-EV和hERO-RPC-EV，发现两者在蛋白质组学图谱上存在显著差异，hERO-RPC-EVs在脂质代谢相关蛋白上富集，可能为治疗视网膜变性（RD）提供新方法。Singh Mandip的研究表明，与人脐带间充质干细胞（hUCMSC）分泌的EV相比，hERO分泌的EV在数量和纳米力学性能上更优越，且晚期类器官分泌的OEV更多，这些OEV能够调节视网膜祖细胞，可能是治疗视网膜退行性疾病的关键介质（图5C、7D）。
3.4表皮类器官OEV用于上皮损伤修复
Lee团队利用iPSC成功培养出表皮类器官（iEpiO），但在2D培养板上失去类器官特征。研究发现，3D培养条件下的iEpiO分泌的EV数量是2D条件下的两倍，且含有更高水平的血管内皮生长因子（VEGF），显著促进了血管生成。小鼠皮肤伤口愈合实验显示，3D-EVs注射治疗的小鼠皮肤愈合率显著提高，免疫组织化学染色也证实3D-EV促进了VEGF的高表达。这些结果表明，类器官从3D转移到2D状态时，其特征和分泌的EV的生物学功能发生显著变化。
OEs在医疗应用中展现出巨大潜力，克服了传统EV的局限性，如提取效率低和功能不足。OEV在某些方面甚至表现出比类器官本身更强的生理效应。随着类器官技术的发展，更复杂的类器官模型，如血管化和神经支配的类器官，可能使OEVs具有更专门的功能，为特定医疗应用量身定制。未来，OEV研究可能受益于其他尖端技术的整合，通过基因工程类器官产生具有特定治疗特性的OEV，为各种疾病创造高度靶向的治疗方式。3D生物打印可以创造更多与生理相关的类器官，增强其产生的OEV的功能和治疗潜力。OEV在推进生物医学科学方面具有巨大潜力，为疾病建模、治疗开发和精准医学提供了多功能和强大的工具，有望成为未来医疗应用的有前途的平台。随着类器官技术的不断进步，将推动OEV研究的进一步突破，为现代医学面临的挑战性疾病的新治疗和干预铺平道路（图5D）。
图5
3.5改装OEV的工程方法
OEV作为新型治疗药物和纳米药物递送系统展现出巨大潜力，但也存在局限性，如缺乏靶向能力。研究者通过工程改造赋予EV新功能，类似策略也适用于OEV以实现特定治疗目标。本文综述了OEV的工程修饰方法，包括间接修饰类器官以获得工程化OEV和直接修饰分离的OEV（图6、表2）。
图6
表2
3.6 工程亲代类器官
亲代修饰是一种有效的EV获取方法，修饰类器官也是获得工程化EV的有效手段。在iPSC构建类器官的背景下，细胞间通讯在分化和形态决定中起着关键作用，而定制的合成受体可以利用合成生物学工程实现细胞间的靶向通信。尽管人工工程和重新设计类器官领域仍处于早期阶段，但合成生物学的发展为设计更复杂的生物组织提供了可能，实现更复杂的生理功能。通过对类器官进行基因修饰，可以获得过表达特定蛋白质的OEV，通过合成生物学手段构建工程类器官，从而获得具有更高复杂功能和更强生理能力的OEV。
3.7 隔离后的工程BEV
对于分离OEV，主要的工程改造目标围绕膜改造和内容改造展开。
3.8 化学工程
研究人员通过共价和非共价反应对OEV膜表面进行修饰。此外，点击化学、醛胺缩合和生物偶联等共价手段也是有效的OEV膜修饰方法。特别是点击化学，通过炔基修饰OEV膜上的胺基，实现OEV蛋白与叠氮化物的正交化反应，从而为OEV膜带来新性能。
3.9 膜融合
OEV的磷脂双分子层使其能自发与其他膜结构融合，从而获得新功能。例如，通过与脂质体共孵育，OEV可以增强OEV与受体细胞的结合能力。
3.10 融合蛋白程序
使用融合蛋白是一种有效的外源物质装入EV的方法。Liu团队通过CD9-HuR融合蛋白技术，成功将miR-26a-5p引入内皮细胞来源的EV（EC-Exos），增强了其促进骨分化的能力。
3.11 电穿孔技术
高强度电场力通过瞬时增加磷脂双分子层的通透性和对周围外源物质的吸收，电穿孔技术能够在不改变转移物质如siRNA的物理性质的前提下，有效将DNA、RNA和蛋白质等外源物质载入OEV中。
4. 类器官和OEV的优势和挑战
4.1 类器官的优势和挑战
类器官技术的发展为生物医学研究提供了新的途径，它们是模拟源组织结构和功能的3D细胞模型，能够模拟多种疾病并已在癌症建模中得到应用。类器官来源于ASC或PSC，前者通过直接分离组织构建，后者复制组织和器官的生长发育过程，为研究人类发育提供新视角。在临床领域，类器官作为动物模型和人体试验之间的桥梁，为个性化药物筛选提供平台，促进高通量药物筛选，研究慢性药物反应，了解药物毒性和耐药机制。类器官移植是技术发展的最终目标，使用患者自身细胞减少免疫排斥，具有强大的再生潜力，实现衰竭器官功能的再生。
尽管类器官技术前景广阔，但也面临挑战，包括缺乏标准化培养标准，导致功能多样性有限，以及缺乏血管网络和免疫神经系统的整合。这些限制要求改进培养方法，整合不同细胞类型，以及开发控制类器官生长和功能的新技术（图7）。
图7
4.2 OEV的优势与挑战
OEV是纳米级的磷脂囊泡，继承了传统EV的多种优点，如含有能调节靶细胞基因表达的生物活性分子、低免疫原性、无细胞系统和高效的递送能力。与传统EV相比，它们具有更高的产量和更强的生理功效，且对工程改造的适应性扩大了其应用潜力。尽管如此，OEV的产量仍是一个挑战，其产量和质量与类器官的数量和质量密切相关。此外，天然OEV存在疗效不理想和缺乏靶向特异性的问题，需要进一步的工程设计来提高其治疗潜力。OEV发挥作用的确切机制尚不清楚，蛋白质和RNA对OEV功能至关重要，但涉及的分子途径尚未完全阐明。类器官和OEV技术仍处于早期阶段，缺乏标准化协议，这限制了OEVs在研究和临床环境中的广泛应用（图7）。
#3
研究结论
Suggestion
本综述探索了类器官技术和OEV在现代医疗领域的革命性应用。类器官不仅能够模拟真实器官的结构和功能，还为疾病研究和新药开发提供了一个强大的平台。而OEV，作为类器官分泌的纳米级囊泡，携带着丰富的生物活性分子，展现出在治疗多种疾病中的巨大潜力。这篇综述详细讨论了类器官和OEV的生物学基础、它们在疾病治疗中的应用，以及通过工程化改造来增强其功能的策略。随着这些技术的不断进步，我们有理由相信，类器官和OEV将为个性化医疗和复杂疾病的治疗带来突破性的进展。
参考文献
Zhou G, Li R, Sheng S, Huang J, Zhou F, Wei Y, Liu H, Su J. Organoids and organoid extracellular vesicles-based disease treatment strategies. J Nanobiotechnology. 2024 Nov 6;22(1):679. doi: 10.1186/s12951-024-02917-3. PMID: 39506799.
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