【心脏类器官】SPEDOX-6在心脏细胞中的安全性和有效性研究

在癌症治疗过程中，化疗药物阿霉素（DOX）会对心脏产生不利影响。因此，有必要开发能保持 DOX 抗癌疗效的非心脏毒性给药系统。研究人员利用人体诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CMs）、内皮细胞（hiPSC-ECs）、心脏成纤维细胞（hiPSC-CFs）、多系心脏球体（hiPSC-CSs）、患者特异性 hiPSCs 和多种人类癌细胞系，比较了单一蛋白包裹 DOX（SPEDOX-6）与标准未配制 DOX 的抗癌效果和降低的心脏毒性。在人类癌细胞、hiPSC-ECs 和 hiPSC-CFs 中进行的细胞活力测定和免疫染色显示，SPEDOX-6 能被大量吸收，并能有效杀死这些增殖细胞类型。相比之下，与 UF DOX 相比，hiPSC-CMs 和 hiPSC-CSs 在 SPEDOX-6 处理期间的细胞毒性要低得多。SPEDOX-6处理过的hiPSC-CMs和hiPSC-CSs可保持其功能，这一点可通过肌节收缩力评估、钙成像、多电极阵列和RNA测序得到证明。这项研究表明，SPEDOX-6 有可能减轻 UF DOX 带来的心脏毒副作用，同时保持其抗癌效力。

图形摘要

这篇文章的研究旨在探讨利用蛋白包裹的阿霉素来减少人类诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CM）和心脏小球的心毒性，同时保持抗癌功效。研究团队通过一系列细胞毒性和功能评估实验，包括细胞存活率的LDH和CCK8细胞代谢测定，以及对心肌细胞收缩和钙信号的评估，来验证这一新方法的有效性。此外，研究还涉及了专利申请和作者的利益冲突声明，以及对相关文献的引用和数据分析方法的描述。

研究方法包括细胞毒性实验、功能评估、细胞成像和信号分析等多个方面。通过这些实验和分析，研究团队得出了关于蛋白包裹的阿霉素在减少心毒性的同时保持抗癌功效方面的重要结论。这些发现对于未来癌症治疗和心脏疾病治疗的发展具有重要意义。

将 DOX 包入 HSA 并对人类癌细胞发挥抗癌功效

主要介绍了将阿霉素（DOX）包裹到人血清白蛋白（HSA）中的方法，并评估了这种包裹方式对人类癌细胞的抗癌效果。研究团队使用了多种人类癌细胞系，包括乳腺癌细胞和纤维肉瘤细胞，对比了未包裹的DOX和包裹在HSA中的DOX（SPEDOX-6）的抗癌效果。实验结果表明，SPEDOX-6与未包裹的DOX在抑制癌细胞增殖方面具有相似的效果。此外，研究团队还通过细胞成像和免疫荧光染色等方法，证实了SPEDOX-6能够快速进入癌细胞内部。

图1 SPEDOX-6 在体外对人类乳腺癌上皮细胞的抗癌效果与 UF DOX 相当。(A) SPE 方法示意图。单个 HSA 分子包裹多个 DOX 分子形成 SPEDOX-6。(B) 使用 SPEDOX-6 的体外系统的实验工作流程。(C) BT-549 乳腺癌上皮细胞在 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 作用 24 小时后的相衬成像。(D) CellTiter-Glo 检测法用于评估 BT-549 细胞在 SPEDOX-6 或 UF DOX 处理 24 小时后的细胞存活率。LD50，50%细胞死亡时的药物浓度。(E) CellTiter-Glo 检测法用于评估 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 处理 24 和 48 小时后 BT-549 细胞的细胞活力。数值越高，细胞存活率越高。(F) UF DOX 或 SPEDOX-6 处理 4 小时和 8 小时后 BT-549 细胞的免疫荧光。HSA 代表人血清白蛋白，DOX 代表阿霉素在 BT-549 细胞中的积累。(G) 与（F）中免疫荧光相对应的核 DOX 信号强度定量。(H）与（F）中免疫荧光相对应的 HSA 和 DOX 核共定位细胞百分比定量。

SPEDOX-6 对 hiPSC-CMs 的细胞毒性降低

研究团队通过细胞成像、细胞毒性测定和细胞代谢活性测定等实验方法，对比了SPEDOX-6和未包裹的DOX对hiPSC-CMs的影响。实验结果显示，相比未包裹的DOX，SPEDOX-6对hiPSC-CMs的细胞毒性更低，并且能够维持细胞的代谢活性和存活率。

图2 SPEDOX-6 在 hiPSC-CMs 中诱导的细胞毒性低于 UF DOX。(A) 对接受 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 治疗2天的 hiPSC-CMs 进行免疫荧光。心肌肌钙蛋白 T（cTnT）是标记横纹肌的 CM 特异性蛋白（插图）。(B) LDH 剂量反应试验，用于评估在 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 处理 3 天后，药物剂量不断增加时，hiPSC-CMs 的细胞毒性。数值越高，表明药物诱导的细胞毒性越大。(C) LDH时程检测用于评估经DMSO、UF DOX或SPEDOX-6处理3天后hiPSC-CMs细胞的细胞毒性。数值越高，表明药物诱导的细胞毒性越强。(D) CCK8 检测法用于评估经 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 处理 72 小时的 hiPSC-CMs 的细胞代谢输出。(E) SPEDOX-6 处理 hiPSC-CMs 长达 3 天的免疫荧光。HSA 代表人血清白蛋白，DOX 代表阿霉素在 hiPSC-CMs 中的积累。(F) UF DOX 或 SPEDOX-6 处理后核 DOX 信号强度的量化。(G) HSA 和 DOX 核共定位细胞百分比定量。

经 SPEDOX-6 处理后，hiPSC-CMs 仍能保持收缩功能

研究团队通过多种实验方法，包括细胞成像、多电极阵列和自动化边缘检测等，对比了SPEDOX-6和未包裹的DOX对hiPSC-CMs收缩功能的影响。实验结果表明，SPEDOX-6处理后，hiPSC-CMs的收缩功能仍能保持在较高水平，而未包裹的DOX则会对其收缩功能产生负面影响。

图3 SPEDOX-6 在 hiPSC-CMs 中诱导的功能毒性低于 UF DOX。（A）在 UF DOX 或 SPEDOX-6 处理 3 天后，hiPSC-CM 的搏动率与 DMSO 正常。(B) （B）用 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 处理长达 72 小时的多电极阵列中收缩的 hiPSC-CMs 的代表性场电位记录。（C）与（B）相对应的多电极阵列中用 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 处理长达 72 小时的收缩 hiPSC-CMs 场电位记录的平均尖峰振幅平均值和场电位持续时间（FPD）平均值。(D) ACTN2-GFP hiPSC-CMs 经 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 作用 72 小时后的实时荧光成像。DOX（红色）表示 DOX 在细胞内的积累。(E) SarcTrack 数据集显示 ACTN2-GFP hiPSC-CMs 经 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 处理 72 小时后具有代表性的肌节位移时间图。(F) 在 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 处理 72 小时的 ACTN2-GFP hiPSC-CM 中，基于 SarcTrack 定量了 hiPSC-CM 收缩周期中的肌节位移。(G) WTC-GCaMP hiPSC-CMs 经 DMSO、UF DOX 或 SPEDOX-6 处理 72 小时后的钙成像时间图。

SPEDOX-6 对 hiPSC-ECs 和 hiPSC-CFs 的心脏毒性

实验结果表明，与未包裹的DOX相比，SPEDOX-6对hiPSC-ECs和hiPSC-CFs的毒性影响相似，这表明SPEDOX-6对这些细胞类型的心脏毒性与未包裹的DOX相当。

图4 SPEDOX-6 在 hiPSC-ECs 和 hiPSC-CFs 中诱导的细胞毒性与 UF DOX 相当，但在多系 hiPSC 衍生的心脏球体（hiPSC-CSs）中却降低了心脏毒性。(A）hiPSC-EC 免疫荧光染色显示血管内皮标志物 CD31（PECAM1）和 CD144（VE-Cadherin）。(B) LDH 细胞毒性测定显示，用 UF DOX 或 SPEDOX-6 处理 3 天的。hiPSC-ECs 的毒性无显著差异。经单向方差分析和 Tukey's 后检验，DMSO 组与其他组之间的(C) 免疫荧光显示 SPEDOX-6 和 DOX 的核积累以及 HSA 在 SPEDOX-6 处理的 hiPSC-EC 细胞核中的积累。(D) 与 C 中免疫荧光相对应的核 DOX 信号强度定量。误差条代表 SD。(E) 与 C 中免疫荧光相对应的 HSA 和 DOX 核共定位细胞百分比定量。误差条代表 SD。(F）hiPSC-CFs的免疫荧光染色显示成纤维细胞标记物波形蛋白和α-平滑肌肌动蛋白。(G)LDH细胞毒性测定显示，用UF DOX或SPEDOX-6处理3天的hiPSC-CFs的毒性无显著差异。∗DMSO 组和其他组之间的 p < 0.05，由单向方差分析和 Tukey 后检验确定。(H）免疫荧光显示 SPEDOX-6 和 DOX 的核积累以及 HSA 在 SPEDOX-6 处理的 hiPSC-CF 细胞核中的积累。(I）与 H 中免疫荧光相对应的核 DOX 信号强度定量。误差条代表 SD。(J) 与 H 中免疫荧光相对应的 HSA 和 DOX 核共定位细胞百分比定量。误差条代表 SD。(K）由 hiPSC-CMs、hiPSC-ECs 和 hiPSC-CFs 按 8:1:1 的比例组成的具有收缩能力的多系 hiPSC-CSs 的实时荧光成像。CM用ACTN2-GFP标记，EC用Tubulin-RFP标记。(L)与 UF DOX 相比，hiPSC-CSs 经 72 小时 SPEDOX-6 处理后，LDH 细胞毒性测定显示细胞毒性降低。DMSO 和其他组之间的(M）药物治疗 72 小时后 hiPSC-CSs 具有代表性的收缩力边缘位移时间图。(N)5个技术重复的hiPSC-CSs。误差条代表 SD。

SPEDOX-6 对含有 hiPSC-CMs、-ECs 和-CFs 的多系 hiPSC 衍生心脏球体的细胞毒性有所降低

实验结果显示，相比未包裹的DOX，SPEDOX-6对这些多种细胞系心脏小球的细胞毒性更低，这表明SPEDOX-6在这种复合细胞结构中具有更低的毒性。

本文的研究结果显示，SPEDOX-6作为一种新型的抗癌药物载体，具有在心肌细胞中降低心脏毒性的潜力。研究团队通过对人类诱导多能干细胞来源心肌细胞、心内皮细胞和心脏成纤维细胞等多种细胞系的实验，证明了SPEDOX-6相比未包裹的DOX在这些细胞中具有更低的毒性，同时仍能保持其抗癌药物的疗效。此外，研究团队还通过对多种细胞系心脏小球的实验，证明了SPEDOX-6在这种复合细胞结构中具有更低的毒性。

这些实验结果为SPEDOX-6作为潜在的抗癌药物载体在心脏细胞中的安全性和有效性提供了重要的实验数据和支持。这项研究为开发更安全、更有效的抗癌药物提供了新的思路和方法，同时也为心脏保护提供了新的策略和方向。这些研究成果对于心脏疾病和癌症治疗领域具有重要的意义和应用前景。

参考信息

Protein-encapsulated doxorubicin reduces cardiotoxicity in hiPSC-cardiomyocytes and cardiac spheroids while maintaining anticancer efficacy.Stem Cell Reports. 2023 Oct 10;18(10):1913-1924. doi: 10.1016/j.stemcr.2023.08.005.PMID: 37657447 PMCID: PMC10656302.