目前在血液学转化研究中的工作通常依赖于用于移植患者来源的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的免疫缺陷小鼠模型，然而这些模型在有效地移植来自患有各种疾病（如骨髓增生异常综合征-MDS）的患者的细胞方面经常面临挑战。美国西北大学Peng Ji团队开发了一种诱导多能干细胞（iPSC）来源的人骨髓类器官模型，密切复制了骨髓微环境，促进了MDS患者来源的HSPCs的植入，从而反映了患者独特的疾病特征。这些发现强调了类器官模型在研究人类造血和血液病病理生理学方面的重要性，为个性化医学和治疗干预提供了新的途径。
#1
研究背景
Background
血液病研究中的一个重大挑战是找到合适的模型系统，在体内密切概括人类病理生理学。免疫缺陷小鼠模型（包括NSG、NSGS和最近的MISTG小鼠）的开发通过促进人造血干细胞和祖细胞（HSPC）在免疫缺陷小鼠的人源化骨髓微环境中的植入而彻底改变了该领域。然而，它仍然是将来自许多疾病如骨髓增生异常综合征（MDS）的HSPCs移植到这些模型中的主要障碍。人类和小鼠之间免疫反应的差异和骨髓微环境的差异通常导致可能无法准确转化为人类条件。
人骨髓类器官是在组织规模上研究人类造血的更合适的模型。过去几十年开发的原型骨髓类器官应用仿生学来复制人类骨髓的三维结构。它们通常补充有饲养细胞和/或外源性提供的生长因子以重建骨髓微环境。然而，这些模型缺乏自主造血和骨髓环境的重现的自我可持续性。使用人诱导多能干细胞（iPSC）来源的骨髓类器官模型领域通过密切模拟天然骨髓的复杂细胞组成和功能解决了许多这些问题。然而，这些iPSC来源的类器官在移植一些更具挑战性的HSPCs中的效果尚未得到探索。
本研究开发了一种iPSC来源的人骨髓类器官模型，能够自主造血并维持骨髓微环境。该系统还能够将来自MDS患者的HSPC有效植入骨髓类器官中，并反映疾病的病理生理学。
#2
研究方法
Methods
使用人iPSCs在21天内将其分化为骨髓类器官模拟造血和骨髓微环境，并验证其特性和造血功能；接着，将CD34+细胞与每个单个类器官一起孵育移植正常骨髓的HSPCs，证明骨髓类器官中生态微环境支持移植供体造血干细胞的能力；然后，将来自不同亚型MDS患者的CD34+ HSPCs移植到骨髓类器官中，研究其在骨髓类器官内的造血功能和病理表现；最后，将来自另外3名MDS患者的样本移植到类器官中，分析移植的MDS HSPCs在类器官中的增殖，存活和自我修复能力以及是否保留其遗传谱。
#3
研究结果
Results
1、人iPSC来源的骨髓类器官的建立
为了模拟人造血和骨髓微环境，研究人员使用人iPSC并在21天内将其分化成骨髓类器官。到第21天，这些类器官形成直径约1000 µm的致密球体。组织学分析证实了它们与微血管内具有造血细胞的人骨髓的相似性。这通过透射电子显微镜（TEM）研究进一步证实，且在血管中容易检测到造血细胞，如红细胞。还检测到其他骨髓成分，包括内皮细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和脂肪细胞。通过全细胞成像，还观察到与基质细胞和造血细胞相互连接的三维（3D）内皮网络。特定谱系的细胞，如红系细胞，位于窦状血管附近和内部。许多成熟红细胞还形成紧密的红细胞岛，其特征与在原发性人骨髓芯活检中发现的特征一致。（图1）
接下来进行流式细胞术测定，验证其多谱系造血，并证明类器官密切复制了人骨髓组成，包括粒细胞、单核细胞、红细胞、淋巴细胞和HSPCs。类器官来源的髓系细胞在骨髓细胞（包括单核细胞）中表达CD11b和CD14。红系细胞表现出混合分化阶段。早期红细胞（CD71+、CD235a-）显示祖细胞标志物CD117的较高表达，而在CD71+、CD235a+晚期成熟红细胞中CD117表达主要为阴性。CD41+巨核细胞群也容易检测到。流式细胞术还表明淋巴细胞群不明确，这可能是由于缺乏外周淋巴组织。类器官来源的CD34+ HSPCs表现出正常的免疫表型，表达CD117，但不表达CD56。研究人员又将骨髓类器官植入免疫缺陷NOD-scidIL2Rγnull（NSG）小鼠的肾囊中确定骨髓类器官是否在体内长期保持其特性和功能。一个月后，大体检查和组织学分析证实植入成功。在11个月内，通过流式细胞术鉴别出人CD45+白细胞和CD235a+红细胞，尽管频率随时间降低。（图2）
图1.人iPSC来源的骨髓类器官模拟人骨髓结构。
图2.人iPSC来源的骨髓类器官支持自主造血。
2、CD34+ HSPCs在骨髓类器官中的植入
血液学转化研究的一个重要障碍是缺乏合适的人体模型，在如MDS的血液病中尤其成问题，来自这些患者的HSPCs很难移植到免疫缺陷小鼠中。因此，研究人员需要探究来自各种类型MDS患者的HSPCs是否可以有效地移植到类器官中。通过将5x103个细胞CellVue标记的CD34+细胞与每个单个类器官一起孵育来移植正常骨髓的HSPCs。72小时后，收集类器官进行全细胞成像分析。结果发现CellVue标记的移植细胞阳性供体细胞在骨髓类器官的实质中很容易被检测到。移植的细胞通常包埋在类器官来源的造血细胞中，特别是在类红细胞岛中。移植的细胞还可以形成局灶性增殖簇，表明对类器官小生态的稳定适应性。3D表面渲染显示UEA1阳性血管内和周围有移植细胞。流式细胞术进一步证实了CellVue标记的供体细胞的植入。这些数据证明了骨髓类器官中的小生态微环境支持移植供体HSPCs的能力，并为使用类器官模拟人类血液病奠定了基础。（图3）
图3.供体HSPCs植入骨髓类器官内。
3、MDS HSPCs植入到骨髓类器官并重现临床表现
接下来利用该系统使用来自不同亚型MDS患者的CD34+ HSPCs研究了骨髓类器官内供体HSPCs来源的造血功能，并与来自正常骨髓个体的相应个体进行比较。三次独立的正常HSPCs移植试验72小时后的流式细胞术分析显示，移植的供体CD34+ HSPCs分化为CD71+红系细胞、CD11b+髓系细胞，并下调CD34表达。与最初从原代骨髓中纯化时的状态相比，CD34+细胞亚群还表达CD11b，表明移植后可能分化为骨髓细胞。接下来，选择了3名具有不同临床表现的MDS患者来测试他们在类器官内的造血功能。共聚焦显微镜显示，来自MDS骨髓样本的CD34+细胞能够有效地移植到类器官内的血管壁微环境中。流式细胞术进一步证实了这一点，更重要的是，反映了患者的临床和病理表现。与正常对照相比，三名MDS患者移植的供体细胞红细胞分化明显降低。类器官中CD11b+髓样细胞的分化谱与患者原发性骨髓流式细胞术结果相关。尽管来自3名MDS患者的细胞都显示出CD34表达的显著保留，但反映HSPCs分化的CD34减少水平在患者2和3中受到的损害更大。这与患者1相比，这两例患者的临床表现和细胞减少情况更差是一致的。（图4）
图4.供体HSPCs移植重现疾病的病理生理学。
4、移植的MDS HSPCs保持自我更新能力和遗传特征
研究人员使用来自另外3名MDS患者的合并样本分析了移植的CD34+ HSPCs的增殖和存活。结果观察到从第5天开始细胞追踪信号逐渐减少。到第15天，细胞追踪信号降低至非染色对照的水平，表明类器官能够维持移植的MDS HSPCs的自我更新。在液体培养基中培养的细胞在5天后未检测到存活的CD34+细胞，相反，移植到类器官中的CD34+ HPSCs显示出显著的存活优势。此外，细胞追踪阳性细胞的总数增加，在植入后第10天，从1000个移植的CD34+ HSPCs产生约16000个造血细胞。又通过二次移植试验进一步测试了这些移植的MDS HSPCs的自我修复能力。事实上，从移植的原代类器官纯化的CD34+和CellTrance+细胞在不同批次的类器官中表现出类似的合适的微环境和分化的效率。（图5）
为了确定移植的MDS HSPC在类器官中的增殖和分化期间是否保留其遗传谱，研究人员将来自3个独立MDS样品的CD34+ HSPCs移植到类器官中。在植入后第10天，使用FACS收集CellVue阳性细胞，并对分选的细胞进行全外显子组DNA测序（WES）。WES显示，移植源细胞在诊断过程中保留了通过下一代测序分析鉴定的突变。诊断样本和类器官移植细胞之间的变异等位基因频率相似。进一步分析携带SF3B1突变并在骨髓涂片中显示环形铁粒幼细胞的患者B2。将移植有来自患者B2的HSPCs的类器官消化到单细胞悬浮液中，并在细胞离心涂片上进行瑞特/吉姆萨和普鲁士蓝染色。环形铁粒幼细胞在染色剂下容易鉴定。这些结果表明，类器官可以为MDS HSPCs提供微环境，以维持其遗传和形态学上的病理特征。（图6）
图5.人骨髓类器官内移植CD34 + HSPCs的增殖和存活分析。
图6.移植产生的造血细胞保留了供体细胞的遗传和形态学特征。
结论
本研究引入了一种可复制的人骨髓类器官模型，不仅能够自主造血，还支持移植的HSPCs的生长和多谱系分化。这一进展代表着我们在理解和利用类器官来研究人类造血和相关疾病病理生理学方面向前迈出了一步。此外，该技术还为研究骨髓相关疾病的不同治疗方法的体外效果，预测体内疗效提供了平台，从而促进了该领域的发展。
局限性是荧光信号随着时间的推移逐渐衰减，这阻碍了移植供体细胞的长期研究。在这种情况下，可以探索替代的细胞跟踪系统，例如遗传条形码或利用来自不同性别的供体细胞和骨髓类器官。
参考文献
Ren K, Li E, Aydemir I, Liu Y, Han X, Bi H, Wang P, Tao K, Ji A, Chen YH, Yang J, Sukhanova M, Ji P. Development of iPSC-derived human bone marrow organoid for autonomous hematopoiesis and patient-derived HSPC engraftment. Blood Adv. 2024 Oct 29:bloodadvances.2024013361. doi: 10.1182/bloodadvances.2024013361. Epub ahead of print. PMID: 39471483.
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