#1
研究背景
Background
3D类器官被广泛用于研究人体器官或组织的生物学和病理学。不同器官和组织之间的相互作用对人体功能的发育和维持至关重要，因此需要建立更复杂的类器官模型，才能更好地再现组织之间的相互影响。NMS轴对人体至关重要，其功能障碍与各种疾病密切相关。NMS轴上的组织在发育初期就相互影响。然而，完整的NMS轴的发育和相互影响尚未通过人体细胞建模组装或开发。在这里，我们对人多能干细胞（hPSC）进行三维分化，构建了NMS类器官，为模拟人类NMS发育和疾病提供了可靠的体外系统。
#2
研究思路
Methods
通过共同开发策略从人类多能干细胞产生hNMSO，然后利用染色、单核RNA测序和空间转录组图谱分析hNMSO，促炎细胞因子刺激类器官，评估hNMSO是否可用于建立NMS相关病理模型。
#3
研究结果
Results
1. 从hPSC生成hNMSO
将H9人胚胎干细胞（hESC）解离成均匀的拟胚体（EB），通过抑制SMAD信号通路，引导干细胞向神经外胚层分化，同时补充脊髓分化的重要调节因子：WNT激活剂、成纤维细胞生长因子（FGF）和视黄酸（RA）。早期诱导阶段（从第0天到第8天）用干细胞维持培养基，骨骼发育需要加入平滑激动剂（SAG）激活SHH信号。值得注意的是，这种方法产生了三组织器官组织（hNMSO），单个类器官内三个不同的自组织结构域的共同发育，这些结构域可以通过明视显微镜进行区分。
hNMSO中三个结构域的自组织分化揭示了在体外系统中再现人类NMS的可能性。经过较长时间的培养，hNMSO中神经元的轴突（Tuj1+）密集地投射到肌肉结构域（TITIN+）。番红O和固绿的化学染色验证了hNMSO中存在离散骨骼结构域。在明视野显微镜下很容易地分辨出三个结构域，对不同批次和不同发育阶段的样品进行定量分析发现hNMSO中产生三个结构域的过程是一致的。
研究团队还检测了不同SAG剂量对hNMSO发育的影响。50、100、200 nM的SAG处理均能诱导相似的谱系，100 nM SAG处理在30天时能够实现三种不同领域的最佳空间分离。因此，hNMSO中的神经、肌肉和骨骼结构域的自组织可能依赖于SAG的剂量。我们还使用更多的hPSC细胞系进行了分化，包括H1 hESC细胞系和hiPSC细胞系（RC01001A）。总共从4个不同的细胞系中生产了1,000多个类器官，平均成功率分别为93.0%（H9）、82.5%（H9-iSHH）、88.0%（H1）和86%（RC01001A）。研究结果表明，hNMSO培育方法适用于不同的hPSC细胞系（图1）。
图1从hPSC生成hNMSO
2. hNMSO具有神经、肌肉和骨骼组织的空间分化特性
为了深入了解hNMSO中的细胞谱系特征，对hNMSO在两个发育时间点（第38天和第75天）进行单核RNA测序（snRNA-seq）分析，共获得8,468个细胞核核（第38天）和4,754个细胞核（第75天）的数据。质量控制后，识别出16个细胞簇，并进一步将其归类为三个主要谱系：神经谱系、肌肉谱系和骨骼谱系，共8个细胞群。神经谱系包含神经元、星形胶质细胞、室管膜细胞和神经前体细胞（NPC），肌肉谱系包含肌肉干细胞（MSC）和骨骼肌细胞，骨骼谱系包含软骨细胞和软骨前体细胞。所有细胞类型都存在于第38天和第75天hNMSO，尽管比例不同，但表明hNMSO分化约1个月足以衍生所有谱系。差异基因表达分析显示所有细胞组中都有明显的细胞类型特异性标志物。GO分析进一步揭示了这些细胞类型特异性基因在神经、肌肉和骨骼发育中的生物学相关性。为了确认类器官来源细胞的真实性，将类器官的基因表达谱与来自不同人类组织的资料进行整合，结果确认了hNMSO衍生的神经谱系细胞与人类脊髓组织相似；hNMSO衍生的骨骼肌细胞和MSC分别与来自人体肌肉组织的骨骼肌和卫星细胞表现出高相似性；与人类骨骼组织的比较证明了hNMSO衍生的软骨细胞和前软骨细胞组的特异性和软骨生成特性。RNA速度分析揭示了hNMSO中的三种发育终点：神经谱系中的室管膜细胞、肌肉谱系中的骨骼肌细胞和骨骼谱系中的软骨细胞。这些结果表明，hNMSO在神经、肌肉和骨骼发育方面与人类组织具有很好的相关性。值得注意的是，没有检测到其他中胚层衍生的谱系（如血管细胞和小胶质细胞）的分化（图2）。
图2 hNMSO的单核和空间转录组特征分析
神经谱系展示了比肌肉和骨骼谱系更为复杂的细胞组成。因此，为了更好地理解hNMSO中的神经特性，对R1区域进行了单核RNA测序。通过snRNA-seq和空间转录组分析，发现R1区域主要包含神经谱系的细胞类型。R1区域的细胞表达HOX基因，提示R1区域具有脊髓样特性。将R1区域与其他不同类型的神经类器官进行比较，也发现R1区域表现出脊髓样特性。为了进一步了解神经元亚群，对神经元群进行了亚群分析，结果显示hNMSO R1区域的神经元主要来源于脊髓的腹侧神经元，特别是V3神经元和运动神经元。为了验证在体内的相关性，将R1区域衍生的神经元与人类脊髓中的神经元亚群进行比较，结果表明R1区域的运动神经元和V3神经元与人类脊髓中对应的神经元最为相似。
为了进一步验证hNMSO中腹源细胞的产生，对来自不同hPSC系的hNMSO进行免疫染色，观察在1个月和2个月发育时的变化。结果显示，不同hPSC系的hNMSO均显示出腹侧脊髓标记基因NKX6-1、更加特异的V3标记基因NKX2-2和脊髓前中区（pMN）标记基因OLIG2的阳性细胞。hNMSOs中的神经组织获得了腹侧特异性身份。因此，虽然神经、肌肉和骨骼组织在发育过程中共同出现和自组织，但hNMSO内的神经组织获得了腹侧特异性身份（图3）。
图3 hNMSO神经域的单核转录组和免疫染色表征
3. hNMSO的神经、肌肉和骨骼成熟
接下来，团队研究了hNMSO的成熟特性。腹源性OLIG2+细胞在长期培养4个月后仍保留在R1神经域，而神经元投射广泛支配R2肌肉结构域。尽管初期肌肉和骨骼区域较为分离，但是长期发育后肌肉组织逐渐包裹住骨骼区域，促进了肌肉和骨骼组织之间的紧密相互作用。通过免疫荧光染色观察到TITIN+肌肉组织包裹骨骼区域，并有神经轴突进行支配。神经元在培养过程中表现出成熟，突触蛋白（SYP）在神经和被支配的肌肉区域广泛分布。
尽管在早期阶段TITIN+骨骼肌较为稀少，随着hNMSO的发育，TITIN+骨骼肌主要分布在R2区域。胶原蛋白（COL1）在R2肌肉区域中分布丰富，而在R1神经区域和R3骨骼区域中未见明显表达，这表明骨骼肌的成熟与生理相关。与R1神经区域获得腹侧特性一致，在R1区域没有大量的PAX7+背侧特异性祖细胞，PAX7+细胞在R2肌肉区域中可以找到。PAX7在增殖的间充质干细胞（MSC）和静止的卫星细胞中表达。在长期培养过程中，肌肉区域中PAX7+细胞以及增殖的Ki67+PAX7+细胞的比例显著减少。因此，hNMSO中的肌肉区域在培养过程中经历了持续的发育和成熟。
高分辨率成像显示，R2肌肉区域的TITIN+肌肉纤维与Tuj1+神经轴突发生了神经支配。这表明R1来源的神经和R2来源的肌肉谱系之间建立了功能连接。SYP突触小体在Tuj1+神经轴突和TITIN+肌肉纤维旁边分布，进一步支持了神经肌肉建立了连接。
AGGRECAN（ACAN）是一种主要由软骨分泌的细胞外基质，在R3骨骼区域的细胞外空间中大量分布。在R3区域，观察到两个或更多细胞被包裹在ACAN基质中，形成典型的腔隙结构，类似于发育中的骨骼组织。与早期阶段相比，长期培养后，SOX9+细胞在hNMSO骨骼区域的比例显著下降，同时骨骼区域的直径增大，表明骨骼的生长和成熟。综上所述，hNMSO中的神经、肌肉和骨骼组织在长期培养过程中展现了空间限制性和组织特异性的成熟过程（图4）。
图4 hNMSO中的神经、肌肉和骨骼成熟和连接
4. hNMSO中的功能性NMS连接和共同开发
为了检测hNMSO的功能，将110-123天的hNMSO附着在多电极阵列（MEA）上进行电活动分析。MEA记录显示，hNMSO表现出强烈的自发性细胞外电信号。为了模拟神经元功能，hNMSO分别接受L-谷氨酰胺（L-GA）和NMDA/5-羟色胺（5-HT）组合的处理以刺激运动回路。MEA结果显示，L-GA或NMDA/5-HT处理显著增强了hNMSO的电活动。使用NBQX和D-2-氨基-5-磷酸戊酸（APV）组合来抑制神经功能，结果显示这种处理抑制了电活动，进一步确认了hNMSO的功能性。通过特定的肌肉收缩记录模块，发现神经脉冲与肌肉收缩之间存在明显的同步化。对神经接触电极和肌肉接触电极的分析显示，神经刺激后肌肉反应强烈。通过在R1神经区域释放MNI-光敏谷氨酸，进行光刺激并在R2肌肉区域进行钙成像，发现R1神经刺激能诱导R2肌肉收缩和钙离子激增。使用Ach受体拮抗剂可以完全抑制钙离子波动，表明神经诱导的肌肉收缩依赖于肌肉细胞中Ach受体的激活。同时，神经靶向的NBQX/APV处理也抑制了光刺激引发的肌肉反应，但自发的肌肉收缩仍然存在。对R2肌肉区域进行光刺激未能引起肌肉反应。光刺激引发的钙离子波动明显强于自发的钙活动，表明光刺激能够显著增强神经和肌肉细胞的钙离子反应。这些结果表明，hNMSO中的神经和肌肉组织能够成熟，并建立功能性连接，支持神经肌肉系统的相互作用和协同工作。
在动物模型中，早期阶段的骨骼已被认为在骨骼肌发育中起到指导作用。在第50天将hNMSO的R3骨骼区域切除，切除后的hNMSO继续发育5周，同时比较完整的hNMSO和R3切除的hNMSO之间的差异。在R3切除后的hNMSO的R2区域，PAX7+细胞总数和增殖的PAX7+细胞数量显著增加，去除骨骼支持后未分化的MSC数量增加。相比之下，在完整hNMSO中，随着类器官的成熟，这些细胞的数量显著减少。这些结果表明，去除骨骼支持可能会干扰hNMSO中骨骼肌的成熟过程。进一步分析发现，R3切除后的hNMSO中肌纤维的直径显著减少。为了研究骨骼支持对肌肉功能发育的影响，通过使用钙成像技术观察了hNMSO中肌肉细胞的钙波动。结果显示，尽管R3切除的hNMSO中肌肉细胞的钙峰频率未受到显著影响，但钙波幅度显著降低，表明骨骼支持对肌肉细胞的功能性发育起到了重要作用。
为了进一步了解骨骼结构域对神经肌肉发育的影响，在第34天将hNMSO的R3骨骼区域移除，在第86天收集完整和去除R3区域的hNMSO中的R1和R2区域，进行转录组分析。PCA分析显示，R1区域和R2区域的转录组分别形成两个主要的簇，无论是完整的hNMSO还是去除R3骨骼的hNMSO，R1和R2区域依然表现出不同的身份特征。比较完整hNMSO中的R2区域和去除R3后的R2区域的基因表达差异，发现有数百个显著变化的基因，相较于R2区域，R1区域的基因表达变化较小。这些上调的基因与骨骼肌的结构和功能密切相关，下调的基因主要与骨骼肌的发育、结构和收缩功能相关。综上所述，通过结构、功能和转录组学的研究，表明在hNMSO中，骨骼支持的出现有助于人骨骼肌的发育（图5）。
5. hNMSO模拟NMS异常
接下来，我们研究了hNMSO是否可用于建立NMS相关病理模型，尤其是关节炎等疾病中的病理表现。一些主要的关节炎疾病常见的促炎介质，例如促炎细胞因子IL-1β，这些细胞因子已被用于动物模型中触发关节炎相关病理。然而，IL-1β对人类神经肌肉系统的影响尚不明确，主要因为缺乏合适的模型。将IL-1β微注射到hNMSO的骨骼区域。结果显示，在IL-1β注射后的hNMSO中，骨骼区域的番红O染色显著减少，表明骨骼的ECM发生退化。同时，COL2A1和ACAN基因表达明显下降，而MMP13基因表达显著增加，提示IL-1β可能通过促炎机制引起骨骼ECM退化。对hNMSO的神经区域进行光刺激并记录肌肉收缩反应。结果显示，注射了IL-1β的hNMSO在神经刺激下肌肉收缩能力严重受损，而对照组（注射载体）则显示出正常的肌肉收缩反应。为了排除IL-1β是否通过培养基影响神经肌肉功能，我们还将IL-1β直接加入培养基作为对照实验。结果表明，直接加入培养基中的IL-1β并未显著影响肌肉收缩反应。在IL-1β注射的hNMSO的肌肉区域，α-BTX和Tuj1染色显示神经肌肉接头（NMJ）显著减少。同时，来自IL-1β注射组的神经（R1）和肌肉（R2）区域的基因表达分析显示，涉及神经过程（如Tuj1和NCAM1）及神经肌肉接头（如MUSK和α-nAChR）相关基因的表达均显著降低。以上结果表明，IL-1β的促炎刺激能够导致人类骨骼组织退化，并损害周围的神经肌肉系统，进一步证明hNMSO是研究与神经肌肉系统相关疾病的潜在模型（图5）。
图5 hNMSO的功能性神经肌肉骨骼串扰和病理变化
小结
本研究通过共开发策略，从人类多能干细胞生成了hNMSO，模拟神经肌肉骨骼轴的相互作用。通过染色、单核RNA测序和空间转录组分析，发现神经、肌肉和骨骼谱系在类器官内自组织并共生。hNMSO中的神经区域表现出腹侧特异性，产生运动神经元，能支配骨骼肌。随着发育，hNMSO逐渐成熟并建立功能连接。结构、功能和转录组分析显示，骨骼支持有助于肌肉发育，hNMSO可用于模拟骨骼退化引发的神经肌肉改变。该模型为研究神经肌肉系统相互作用及相关疾病提供了可行的实验平台。
参考文献
Yin Y, Zhou W, Zhu J, Chen Z, Jiang L, Zhuang X, Chen J, Wei J, Lu X, Liu Y, Pang W, Zhang Q, Cao Y, Li Z, Zhu Y, Xiang Y. Generation of self-organized neuromusculoskeletal tri-tissue organoids from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 2024 Dec 6:S1934-5909(24)00404-1. doi: 10.1016/j.stem.2024.11.005.
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