小鼠睾丸类器官的生成及其冷冻保存

在探索人类生育奥秘的实验室里，一个微小却具有革命性的突破正在发生：科学家们成功地在试管中培育出了高度模拟真实睾丸结构的“微型器官”。这些在实验室里“长大”的微型器官，不仅外观上与真正的睾丸无异，就连内部的细胞组成和排列也高度相似。它们是如何被创造出来的？又是如何被神奇地“冻结”以待未来使用的？跟随我们，一起探索这场在显微镜下进行的生命奇迹，揭秘科学如何让不可能成为可能。

睾丸类器官在维持及潜在恢复男性生育能力方面展现出巨大的应用前景。然而，当前关于构建具备睾丸特异性结构与功能的类器官的研究尚处于初级阶段，且面临诸多挑战与限制。

尤为值得关注的是，睾丸类器官的冷冻保存技术研究有限，不恰当的冷冻方法可能严重损害类器官复活或再生后的特性，进而无法满足临床治疗或科学研究的实际需求。

鉴于此，本研究旨在深入探究小鼠年龄和细胞数量对睾丸细胞自聚集成球体的影响。研究通过对比不同培养基配方、培养体系及细胞数量的影响，来优化睾丸类器官的形成条件。同时，本研究将进一步确定适用于睾丸细胞、细胞球体及组织的理想冷冻保存方案，以确保其在冷冻-复苏过程中能够保持最佳的功能与特性。

图1

1. 睾丸细胞球形形成参数的优化

为了确定稳定细胞球形成条件，研究人员对比了不同年龄小鼠（2周、3周、5周）的睾丸细胞在不同细胞密度下随时间的变化。研究发现，仅2周龄小鼠的睾丸细胞能在48至72小时内成功聚集成细胞球，而较大年龄小鼠的细胞则未能形成球体。此外，2周龄小鼠的睾丸细胞自聚集率随接种密度的增加而上升，且培养时间延长有助于细胞球的形成，尤其在低密度条件下显著。细胞球直径与细胞数量正相关，但与培养时间负相关，这归因于外周细胞的内向迁移使球体更紧凑。体积较大的细胞球展现出更高的结构稳定性和弹性。因此，后续实验将采用2周龄小鼠的原代睾丸细胞，在低吸附剂板中培养72小时以获取稳定的细胞球（图2）。

图2

2. 培养基成分对睾丸类器官自组装的影响

睾丸由复杂的管状结构构成，涉及支持细胞、管周肌样细胞等体细胞，对男性生殖细胞至关重要。为探究培养基成分对睾丸类器官自组装的影响，研究在α-MEM（含不同比例KSR和FBS）的琼脂糖水凝胶上培养了睾丸细胞球。结果显示，10% KSR组类器官展现出规则的管状结构，高度模拟体内睾丸，且细胞分布与体内相似。相比之下，10% FBS组管状结构不规则，生殖细胞少；而5% KSR + 5% FBS组则介于两者之间。统计分析表明，10% KSR组在管状结构及细胞类型发生率上优于其他组。因此，本研究确定含10% KSR的α -MEM为睾丸类器官培养的最佳培养基（图3、4）。

图3

图4

3. 培养系统对睾丸类器官自组装的影响

研究将含有30×10⁴个睾丸细胞的细胞球置于含10% KSR的α-MEM培养基中14天，以评估不同培养体系（琼脂糖水凝胶、AlgMA水凝胶、Transwell）对睾丸细胞自组装成类器官能力的影响。结果显示，琼脂糖水凝胶体系下形成的睾丸类器官在形态与细胞排列上最接近体内睾丸，而AlgMA水凝胶体系中虽形成部分管状结构但伴有不规则细胞分布，Transwell体系中则仅见少量管状结构及松散的细胞排列。综合比较各体系的相对小管面积、各类细胞相对数量等指标，均发现琼脂糖水凝胶体系表现最优，因此被选定为最佳睾丸类器官培养体系（图5）。

图5

4. 细胞球大小对睾丸类器官自组装的影响

研究在琼脂糖水凝胶培养体系中，使用含10% KSR的α-MEM培养基培养不同大小（10×10⁴、30×10⁴、70×10⁴个睾丸细胞）的细胞球14天，以比较其自组装成睾丸类器官的能力。结果显示，所有体积的细胞球均能形成睾丸类器官，但形态和细胞排列各异。中等体积（30×10⁴细胞）的类器官最接近于体内睾丸，既有管状结构也有丰富的支持细胞，且生殖细胞数量显著增加。小体积类器官管状结构少，几乎无生殖细胞；大体积类器官则管状结构丰富但生殖细胞稀少，且因缺氧和营养交换问题导致中心坏死，凋亡率高。综合考虑，中等体积的睾丸类器官在弹性、稳定性和生殖细胞数量上表现最佳，故选择30×10⁴个睾丸细胞组成的细胞球作为本研究的最优培养体积（图6）。

图6

5. 睾丸细胞与冷冻睾丸组织自聚集细胞球的比较

现有研究对原代睾丸细胞冷冻方法未形成共识，普遍报告冷冻后细胞活性低。本研究通过比较不同冷冻保护剂组合，发现含10% DMSO的配方在细胞存活率和回收率上表现最佳，且FBS与KSR作为添加剂效果相当。因此，确立了含10% DMSO的慢速冷冻程序为最优方案。进一步对比睾丸组织与细胞冷冻后的自聚集情况，发现组织冷冻在细胞活力和活细胞数上更优，但细胞冷冻在聚集速度和球体弹性上表现更佳。这表明尽管组织冷冻能更好保持细胞微环境，却可能影响细胞自聚集能力和稳定性（图7）。

图7

6. 睾丸细胞球的缓慢和快速冷冻

研究分析了不同冷冻保护剂组合及冷冻速度对睾丸细胞球凋亡的影响。结果显示，在慢速冷冻中，5% DMSO + 5% EG的组合显著降低了细胞凋亡率，成为最佳方案；而在快速冷冻中，30% DMSO则表现最优，但凋亡率仍高于慢速冷冻的最佳组合。因此，选择含5% DMSO + 5% EG的α-MEM进行慢速冷冻保存，并成功应用于睾丸细胞球培养实验以生成类器官。不同体积的睾丸类器官在生物医学应用上各有优势，较小的类器官特别适合于药物筛选研究，而较大的睾丸类器官可能在体外诱导精子发生和治疗不孕症方面具有更大的潜力和效率。研究大体积睾丸类器官冷冻保存方法发现，对于大体积细胞球，慢速冷冻在减少凋亡方面优于快速冷冻，这表明，慢速冷冻可能是大体积睾丸细胞球冷冻保存的有效技术（图8）。

图8

7. 由冷冻睾丸细胞、组织和细胞球生成的睾丸类器官

通过将不同来源的冷冻样本在琼脂糖水凝胶上培养14天，类器官得以形成。结果显示，使用冷冻细胞培养的类器官形态最为接近自然睾丸，具备明确的管状结构和良好的细胞排列。相比之下，由冷冻组织和冷冻细胞球生成的类器官则表现出不同程度的结构不规则性和细胞分布无序性。定量分析进一步证实，从冷冻细胞衍生的类器官在维持小管面积、支持细胞及生殖细胞等方面表现最佳。这些发现表明，睾丸细胞的低温保存是保存类器官分化特性和维持细胞间相互作用的最有效方法（图9）。

图9

本研究成功培育出了结构与功能均高度模拟自然睾丸的小鼠睾丸类器官。这些微型器官不仅展现出惊人的自我组织能力，形成了清晰的管腔结构，其内部细胞构成——包括Sertoli细胞、生殖细胞及环绕的肌样细胞——的分布模式，也与真实睾丸组织极为相似。更重要的是，研究团队还开发出了一种有效的冷冻保存方法，能够将这些类器官长期保存，为未来的再生医学和生育力保护提供了新的策略。

这项研究的意义不仅在于它为男性不育症的治疗带来了新的希望，也为研究睾丸发育、精子生成以及相关疾病提供了一个强大的实验工具。通过这些类器官，科学家们可以在更加贴近体内生理环境的条件下，系统性地研究环境变迁、药物干预及疾病状态对睾丸功能的具体影响，从而为精准医疗时代下的新疗法开发奠定坚实的科学基础。随着技术的不断进步，未来我们或许能够见证从实验室培养出的睾丸类器官为患者带来生育的奇迹。

参考文献

Tan J, Li J, Lin C, Ye N, Zhang H, Liu C, Han S, Li Z, Zhou X. Generation of mouse testicular organoids with highly compartmentalized tubular lumen structure and their cryopreservation. Life Sci. 2024 Oct 15;355:122980. doi: 10.1016/j.lfs.2024.122980. Epub 2024 Aug 13. PMID: 39147312.