在人类与癌症的斗争中，每一次技术的突破都可能为患者带来新的希望。最近，一项关于肺癌治疗的创新研究引起了科学界的广泛关注。科学家们正在尝试一种创新的方法——利用诱导多能干细胞（iPSC）衍生的细胞外囊泡（EV）携带着化疗药物，实现对肿瘤细胞的精准递送。想要了解这些细胞是如何成为我们对抗肺癌的新武器的吗？跟随我们一探究竟吧！
#1
研究背景
Background
肺癌是全球癌症死亡的主要原因，其发病率和死亡率一直居高不下。尽管近年来靶向治疗和免疫治疗取得了显著进展，但如何进一步提升治疗效果并降低系统性毒性，仍是亟待解决的关键问题。EV作为药物递送系统，凭借其出色的生物相容性和低免疫原性特性，受到了广泛关注。iPSC技术的发展，为疾病建模、药物筛选和个性化医疗提供了新的平台。
本研究旨在探索使用iPSC衍生的间充质基质细胞（MSC）产生的EV作为顺铂的递送载体。iPSC-MSC来源的EV因具备优异的生物相容性和极低的免疫原性，而被视为极具潜力的药物传输媒介。通过将顺铂封装在这些EV中，研究者希望开发出一种新的个性化治疗方法，以提高药物的靶向输送效率并减少副作用，从而为肺癌治疗提供一种新策略。
#2
研究思路
Methods
将健康肺成纤维细胞重编程为iPSC。
将患者源iPSC分化为分支肺类器官（BLO）和肺癌类器官（LCO）。
从iPSC-MSC中分离出细胞外囊泡（EV），并将0.07 µg/mL的顺铂封装在EV中，然后应用于两种类器官模型。
使用LDH和CCK8测试记录顺铂和顺铂装载EV的细胞毒性。
#3
研究结果
Results
1. 从非小细胞肺癌患者来源的肺成纤维细胞生成iPSC
为了从非小细胞肺癌（NSCLC）患者中生成健康的iPSC，研究团队首先从手术样本中获取健康的肺组织，分离并在体外培养细胞。经过确认，这些细胞为正常成纤维细胞，且大部分表达CD90表面标志物。随后，团队利用携带特定基因的仙台病毒粒子对健康肺成纤维细胞进行转染，并与小鼠胚胎成纤维细胞共培养，成功诱导出iPSC菌落。
研究选取了来自两位患者的iPSC克隆进行进一步分析，这些克隆表达多能性因子，并展现出正常的核型。在诱导分化为中胚层、内胚层和外胚层的过程中，相关基因的表达发生了显著变化，验证了这些iPSC克隆的分化潜能。
此外，对iPSC进行检测发现，仙台病毒基因组和部分转基因基因在iPSC克隆中已缺失，但c-MYC转基因在部分克隆中仍持续存在。尽管如此，从这两位患者中选择的iPSC克隆仍显示出了成功重编程的所有特征，并被认为是功能齐全的。
因此，这些患者来源的iPSC克隆（LC0001 cl16和LC0008 cl20）具有分化为肺类器官和iPSC衍生的间充质干细胞（iPSC-MSC）的潜力，可用于后续研究（图1）。
图1
2. iPSC分化为肺类器官，分离出患者来源的肺癌类器官
为生成健康的肺类器官，研究采用商业试剂盒对LC0001和LC0008的iPSC克隆进行分化。最初，诱导了明确的内胚层分化，第1天观察到单层细胞，第4天出现前肠内胚层（AFE）芽，第7天收获并进行悬浮培养形成球状结构。随后，球体被播种到Matrigel三明治培养基中培养至少42天，形成密集排列的肺类器官，并在第49天形成带有薄层极化细胞的芽。通过免疫荧光分析，成熟的iPSC衍生的肺类器官表达了多种肺细胞标志。同时，利用肺癌手术样本建立了患者匹配的LCO，并表现出NSCLC特异性标志物的强烈表达。总之，健康的iPSC衍生的肺类器官和患者匹配的肺癌类器官在体外成功构建，可用于后续的药物毒性作用研究（图2）。
图2
3. iPSC - MSC的生成和表征
为制备iPSC-MSC衍生的EV，研究人员选取了一个患者来源的iPSC克隆（Fib3iPSC cl20，LC0008）进行分化为MSC，并对所得细胞进行了全面表征。在分化过程中，iPSC经历了形态变化，从紧密排列的菌落转变为纺锤体形态的细胞。完全分化的iPSC-MSC在第35天进行了流式细胞术分析，结果显示其CD90和CD105表达高于亲本iPSC克隆，且造血分化标志物阴性，证实了其正确的细胞身份。此外，与iPSC相比，iPSC-MSC中OCT4表达下调，但仍高于完全分化的成纤维细胞。三谱系分化实验显示iPSC-MSC能成功分化为软骨细胞，脂肪和成骨分化程度较低。细胞活力和细胞毒性分析表明，高浓度顺铂对iPSC-MSC有影响。同时，iPSC-MSC在传代4至9期间呈指数增长，适合用于EV的生产和分离（图3）。
图3
4. iPSC - MSC衍生EV的表征
为了生成EV，研究人员在T175烧瓶中扩增了患者LC0008的iPSC-MSC（P4-P9），并在更换培养基时收集含有EV的培养基，分离细胞碎片后对EV进行浓缩。顺铂装载到EV上时，在培养基中加入顺铂48小时，然后按照非装载EV的方式进行EV分离。采用TEM和dsELISA对EV进行表征，结果显示不同分离的EV大小无显著差异，但装载顺铂的EV含有更多颗粒/mL（尽管差异无统计学意义）。HPLC分析表明，EV成功装载了0.07µg/mL的顺铂。dsELISA分析显示，所有测试样本中CD63表达水平大致相同，且EV阴性标记物calnexin在分离的EV中不存在，表明EV群体纯净。综上所述，成功从iPSC-MSC中分离出EV并装载顺铂，这些EV及未装载的EV将用于后续步骤中处理iPSC衍生的BLO和患者匹配的LCO（图4）。
图4
5. iPSC衍生的类器官和患者匹配的肺癌类器官暴露于EV
为了评估自体EV装载顺铂的效果，研究人员对MSC-EV、EV+cispt和顺铂处理后的BLO和LCO进行了RNA分离和RT-qPCR分析，并进行了CCK8和LDH测定以评估细胞毒性。结果显示，EV可诱导LCO中LDH释放，且对BLO有轻微细胞毒性，但不如LCO明显。顺铂处理有增加LCO代谢活性的趋势，与凋亡相关基因上调一致。然而，CCK8测试显示，无论是EV还是顺铂治疗，都没有显著影响LCO和BLO的代谢活性。对凋亡相关基因的分析显示，EV+cispt在患者匹配的LCO中轻微上调了这些基因的表达，但在iPSC来源的BLO中无变化。尽管在LCO中基因表达略有上调，但LDH实验未检测到细胞毒活性。此外，异体EV+cispt暴露增加了FASL基因表达，而自体EV治疗对凋亡相关基因无影响或下调。20µg/mL顺铂上调了LCO和BLO中的凋亡相关基因，但CASPASE-7在LCO中的上调幅度远大于BLO（图5）。
图5
小结
本研究成功地利用iPSC衍生的肺和肺癌类器官模型，评估了顺铂封装于自体iPSC-MSC来源的EV中的可行性。这一创新方法有望提高药物的靶向性，减少系统性毒性，为肺癌患者带来更为精准的治疗方案。
尽管初步实验显示，这种新型药物递送系统在体外实验中对肺癌类器官的影响有限，推测可能是由于顺铂封装量不足所致，但这一发现无疑为未来肺癌的个性化治疗提供了新思路。研究还指出，尽管iPSC-MSC EV作为药物载体具有巨大潜力，但目前备流程及药物封装步骤繁琐且耗时，一定程度上阻碍了其在个性化医疗领域的广泛应用。
最终，研究者们强调了进一步研究的必要性，以优化EV的制备和药物封装技术，从而提升治疗效率。本研究的成果为未来的治疗策略提供了宝贵的见解，并为肺癌治疗领域带来了一线希望。随着技术的不断进步，我们有理由相信，这种创新疗法将为肺癌患者带来更加光明的未来。
参考文献
Küstermann C, Narbute K, Movčana V, Parfejevs V, Rūmnieks F, Kauķis P, Priedols M, Mikilps-Mikgelbs R, Mihailova M, Andersone S, Dzalbs A, Bajo-Santos C, Krams A, Abols A. iPSC-derived lung and lung cancer organoid model to evaluate cisplatin encapsulated autologous iPSC-derived mesenchymal stromal cell-isolated extracellular vesicles. Stem Cell Res Ther. 2024 Aug 7;15(1):246. doi: 10.1186/s13287-024-03862-6. PMID: 39113093; PMCID: PMC11304910.
“
”
添加客服小助理，获取原文PDF
往期推荐
IF19.8！南方医科大学白晓春、高学飞团队构建人软骨类器官药物筛选系统，确定软骨再生新靶点
Cancer Cell | 中山大学一附院于君团队发表高水平研究：具核梭杆菌有助于微卫星稳定型结直肠癌的抗PD-1治疗
Nature、Science齐发！成功开发毛发皮肤类器官-巨噬细胞共培养模型并创建产前人类皮肤图谱
IF=48.8 | Cancer cell：通过与患者来源的类器官共培养验证TRGC2+ NKT细胞在食管鳞癌免疫治疗反应中作用
