荷兰皇家艺术与科学院Hans Clevers团队研究报道了从妊娠8-17周（8-17GW）胎儿胰腺样品中衍生的18个人胎儿胰腺类器官（hfPO）系，其中4个细胞系衍生自15-16个GW样品，在优化的培养条件下，产生腺泡、导管和内分泌谱系细胞，持续扩增超过2年。单细胞RNA测序鉴定胎儿胰腺和hfPO中罕见的LGR5+细胞，作为发育层次的基础。这些LGR5+细胞与成人胃肠道干细胞共享多个标记。来自单个LGR 5+类器官细胞的类器官在体外重现了这种三能性。
#1
研究背景
Background
胰腺具有外分泌和内分泌两种功能，其中外分泌胰腺的腺泡细胞负责分泌消化酶。尽管小鼠体内模型为胰腺发育提供了深入见解，但人类胰腺生物学研究受限于人-小鼠差异，主要依赖形态学方法。近期，转录组研究和人类多能干细胞（hPSC）分化方案为理解胰腺细胞分化提供了新视角，尤其是B细胞的产生。类器官技术的发展，特别是从iPSC或组织驻留干细胞（TSC）生长的类器官，为模拟整个胰腺提供了新模型，尽管它们主要集中于产生胰岛素的B细胞。此前的研究尝试从成年小鼠和人类原发性胰腺TSC中建立类器官，但这些模型在体外倾向于导管谱系，缺乏腺泡和内分泌细胞。本研究旨在从天然指定的胎儿胰腺TSC产生一个体外模型系统，以反映上皮胰腺的复杂性，包括腺泡和内分泌细胞，为深入理解胰腺发育和功能提供新的视角。
#2
研究方法
Methods
首先，从跨越妊娠周（GW）8-17的20个独立组织样品建立18个hfPO系的小生物库；
然后，通过mRNA-seq，转录组谱和差异基因表达分析评估出芽和囊性hfPO之间的差异；
接下来，促进进一步成熟为能够产生消化酶的腺泡细胞；
最后验证hfPO能够向内分泌谱系分化。
#3
结果
Results
1、hfPO的长期培养
对来自妊娠早期和妊娠中期的人胎儿胰腺组织进行处理并包埋在基底膜提取物（BME）基质中。3天后，在大多数培养基条件下出现小的囊性结构。10-14天后，仅在一种培养基（人胎儿胰腺类器官（hfPO）培养基）中观察到深色的、出芽的葡萄样结构的出现。从跨越妊娠周（GW）8-17的20个独立组织样品建立18个hfPO系的小生物库。出芽的类器官仅出现在来源于14-16 GW样品的培养物中。“最老的"出芽系已连续培养3年。仅在出芽的类器官中观察到罕见的嗜铬粒蛋白-A（CHGA）阳性细胞（图1）。
图1.hfPO的建立
2、出芽的类器官表达腺泡祖细胞标志物
手动分离来自相同系（hfPO 1、hfPO 2、hfPO 5）并在相同（hfPO扩增）培养基中培养的出芽和囊性hfPO，以及来自纯囊性系（hfPO 7、hfPO 8）的hfPO，并通过批量mRNA测序（mRNA-seq）进行分析。转录组谱表明，囊性和出芽hfPO分别成簇。差异基因表达分析显示，与囊性hfPO相比，腺泡标志物（羧肽酶A1[CPA 1]、RBPJL和PTF 1A）的表达在出芽hfPO中更显著，而导管标志物（角蛋白7[KRT 7]、粘蛋白1[MUC 1]和CEACAM 6）的表达更低。还观察到内分泌标志物（NEUR 0 G 3、CHGA和CHGB）在出芽的hfPO中的表达。此外，来自在原始haPO培养基中培养的15至16个GW样品的hfPO不表达腺泡或内分泌祖细胞基因。因此，hfPO培养基支持分化为导管，而hfPO培养基允许所有三种胰腺细胞谱系的标志物的表达，但在15-16个GW衍生的类器官系中是独特的（图2）。
图2.出芽型hfPO与囊性hfPO不同
3、hfPO产生腺泡谱系的细胞
研究人员应用CRISPaint用荧光蛋白tdTomato在C末端标记腺泡基因CPA 1和PTF 1A。这也允许随后分离和分析表达这些腺泡基因的细胞。在hfPO暴露于生长因子耗尽的分化培养基（hfPO-AC）培养基7天后，使用荧光显微镜和荧光激活细胞分选（FACS）分析观察到基因表达水平以及CPA 1+和PTF 1A+细胞数量的增加。这通过批量mRNA-seq进一步证实，其揭示了与腺泡细胞相关的基因的上调以及消化酶的表达（例如，CTRB/C、CEL和CEL 2A/3A）。研究人员通过透射电子显微镜（TEM）确定hfPO的分化是否导致这种颗粒的形成。这揭示了作为成熟的进一步标志的分泌囊泡的存在。此外，使用全计数免疫荧光可视化CPA 1+和PTF 1A+细胞并确认蛋白质表达。研究人员还观察到消化酶胰蛋白酶、RNA酶、脂肪酶、胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样弹性蛋白酶3A（CELA 3A）在蛋白质水平的表达增加以及表达消化酶的细胞数量增加（CTRC）。通过ELISA和酶活性测定来评估胰蛋白酶和脂肪酶的酶分泌。结果显示，虽然脂肪酶在扩增（hfPO培养基）和分化（hfPO-AC）培养基下都能分泌，但酶活性在两种条件下没有显著变化（图3）。
图3.hfPOs向腺泡谱系的分化
4、hfPO产生内分泌谱系的细胞
为了能够在分化后鉴定和分离内分泌细胞，研究人员生成了内分泌报告基因hfPO系。克隆CHGA-hfPO报告类器官的选择和扩增之后，在扩增培养基中观察到罕见的dTomato+细胞。在hfPO-EC培养基中7-10天后，该数目增加5-10倍。通过mRNA批量测序，在扩增与分化培养基中培养的hfPO分别成簇。而且，CHGA的表达增加以及胰腺激素GCG、INS、生长抑素（SST）、GHRL和PPY的mRNA的出现。此外，TEM证实存在内分泌细胞特征性的囊泡。免疫荧光显示多激素细胞和单激素细胞的存在。内分泌谱系主转录因子NEUROG 360的表达进一步支持了早期内分泌细胞的持续新生。hfPO产生内分泌细胞的效力在培养物中持续存在，因为RTqPCR显示hfPO在体外扩增2年后仍然可以产生INS产生细胞。最后，c-肽的ELISA显示hfPO能够在分化后产生和分泌c-肽。总之，这支持hfPO能够产生更多分化的内分泌细胞（图4）。
图4.hfPO可向内分泌谱系分化
5、hfPO细胞概括了原代人胎儿胰腺组织的关键方面
在研究中，研究人员将hfPO-和hfPO-EC培养基中生长的hfPO的转录组数据与相似发育阶段的人类胎儿胰腺组织数据集进行了对比分析。经过质量控制，三个数据集合并成一个包含11755个细胞的数据集，hfPO细胞占总细胞数的20%。分析结果显示，hfPO与胎儿组织细胞之间存在高度重叠，特别是在14和16周的妊娠期间。四个主要的细胞簇被识别出来，其中三个对应于胰腺的主要细胞谱系，第四个表达干细胞标志物如SOX9和PROM1。hfPO细胞在干细胞簇中的贡献较为显著。鼠胰腺多能祖细胞的标记基因在hfPO细胞中得到表达，与人类胎儿胰腺的干/祖细胞相似。此外，转录因子GATA 4/6的表达模式与预期一致，GATA4在腺泡区室表达增加，而GATA6定位于导管和内分泌区室（图5）。
免疫组织化学染色显示，hfPO与胎儿和成人胰腺组织在结构和标记基因表达上存在差异。hfPO产生的腺泡细胞与孕早期和孕中期胎儿胰腺组织在基因表达和水平上非常相似，而妊娠中期后期的胎儿组织更接近成人组织。hfPO还能产生多种消化酶，其导管细胞与妊娠早期组织相似，并能产生MUC1。hfPO衍生的B细胞也能产生胰岛素（INS），尽管成人组织中INS的表达水平更高。总体而言，hfPO在转录组谱和消化酶、粘液及激素产生方面与胎儿状态相似，表明其能够表型复制胎儿胰腺组织的特征（图6）。
图5.hfPOs在单细胞转录组水平上转录人胎儿组织
图6.hfPOs概括了人胎儿胰腺组织
6、LGR 5标记人类三能干细胞
研究人员通过单细胞克隆技术培育出类器官，并将其在特定培养基中扩增10天，以诱导不同的胰腺细胞命运。经过质量控制的scRNA-seq数据分析显示，这些类器官细胞可以分为五个主要的细胞簇，分别代表祖细胞、腺泡祖细胞、腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞。特别是，表达高水平的上皮干细胞标志物LGR5和TROY的细胞位于祖细胞簇的顶部。通过原位杂交和报告基因技术，研究人员证实了LGR5+和TROY+细胞的存在，并评估了它们的类器官形成能力和干细胞特性。LGR5+细胞显示出更高的类器官形成能力，表明它们具有干细胞特性。进一步的实验显示，不同的培养基可以促进类器官向内分泌/腺泡或腺泡和导管细胞分化。移植实验中，这些类器官在免疫缺陷小鼠中生长，并表现出包含所有三种胰腺细胞谱系的人类细胞。这些结果证实了单个LGR5+干细胞能够产生包含所有三种胰腺细胞谱系的类器官，为胰腺发育和疾病研究提供了重要的体外模型（图7）。
图7.LGR5标记三能人胰腺祖细胞
小结
这项研究成功从15至16周的人类胎儿胰腺中，建立了一个稳定的类器官系。这些类器官能够从单个LGR5+多能祖细胞发展而来，并保持分化为腺泡细胞、导管细胞和内分泌细胞的能力。这些胰腺祖细胞的长期体外扩增潜力以及易于遗传修饰的特点，为研究人类胰腺的发育、生理和疾病提供了新的实验平台。此外，这一胰腺类器官平台有望推动再生医学的发展，通过细胞治疗或特定生长因子的靶向治疗来修复胰腺功能障碍。
不同地区对人类胎儿组织实验的法律和伦理规定存在差异。LGR5+细胞被认为是人类的多能胰腺祖细胞，但它们与其他祖细胞群体之间的确切关系以及这些群体的可塑性仍需进一步研究。改进成熟的培养方案对于生成与成人组织相匹配的外分泌/腺泡和内分泌细胞至关重要。
参考文献
Andersson-Rolf A, Groot K, Korving J, Begthel H, Hanegraaf MAJ, VanInsberghe M, Salmén F, van den Brink S, Lopez-Iglesias C, Peters PJ, Krueger D, Beumer J, Geurts MH, Alemany A, Gehart H, Carlotti F, de Koning EJP, Chuva de Sousa Lopes SM, van Oudenaarden A, van Es JH, Clevers H. Long-term in vitro expansion of a human fetal pancreas stem cell that generates all three pancreatic cell lineages. Cell. 2024 Dec 2:S0092-8674(24)01254-6. doi: 10.1016/j.cell.2024.10.044. Epub ahead of print. PMID: 39626658.
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